MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Методы видеоцифровой регистрации

фото Методы видеоцифровой регистрации
В регистрации результатов биохимических, иммунохимических и других лабораторных исследований доминируют фото- и рефлектометрические системы, что обусловлено значительным парком фотометрических приборов, отработанными методическими схемами их применения и производственными мощностями для производства этого оборудования.

Однако одной из очевидных тенденций модернизации лабораторной диагностики является все более широкое внедрение компьютерных и информационных технологий, в частности замена традиционных систем регистрации на комплексы, базирующиеся на подходах видеоцифровой регистрации. Масштабному внедрению видеоцифровых систем способствуют многие факторы, среди которых постоянно улучшающиеся технические характеристики приборов получения изображений — видеокамер и сканеров, их экономическая доступность, развитие и массовое использование информационных и коммуникационных технологий.

Помимо факторов, связанных с общими достижениями научно-технического прогресса, существуют и конкретные аналитические преимущества видеоцифровой регистрации перед традиционной фотометрией, которые позволяют получать дополнительную информацию об изучаемых объектах, совершенствовать имеющиеся и создавать новые лабораторные методики.

Системы видеоцифровой регистрации дают возможность получать изображение образца, представляющее собой совокупность количественно измеряемых сигналов, отвечающих большому количеству точек — пикселей аналитического объекта (например, лунки микропланшета или иммунохроматографической тест-полоски).


При видеоцифровой регистрации на один объект приходится большое количество (от сотен до нескольких тысяч) регистрируемых цифровых характеристик, которое определяется пространственным разрешением соответствующего устройства. В случае однородных объектов при видеоцифровой регистрации эти характеристики усредняются (обычно берется не менее тысячи значений) и вычисляется оптическая плотность или коэффициент светоотражения, как и при обычной фотометрии.
видеоцифровой регистрации.

Для неоднородных объектов видеоцифровой регистрации позволяет численно охарактеризовать получаемую картину по степени дисперсии (неоднородности) или другим параметрам, отражающим интенсивность прохождения аналитической реакции с последующим представлением результатов в зависимости от поставленных задач. Таким образом, возможность анализа изображения объекта позволяет либо установить наличие и исключить влияние артефактов - неоднородностей в однородном образце, либо, если неоднородность несет диагностически значимую информацию, получить ее аналитические характеристики, выраженные в численном виде.

Помимо этого, видеоцифровая регистрация обеспечивает сохранение первичного изображения, фиксирующего полную информацию об объекте в конкретный, определяемый лабораторной методикой момент времени, которое может быть названо первичным документом теста, что имеет самостоятельную ценность.


Такое документирование и архивирование результатов обеспечивают возможность ретроспективного контроля выполненного исследования, что повышает ответственность персонала, может придать юридический статус исследованию и ставит барьер на пути ошибок и фальсификаций. Возможность возвращаться к передаче первичной информации через некоторое время позволяет отслеживать динамику изменения лабораторных параметров, консультироваться при неоднозначных результатах, оценивать эффективность лечения, сравнивая непосредственно результаты. Немаловажное значение имеет и возможность передачи первичной информации через Интернет, в том числе и при проведении анализов у постели больного и в полевых условиях, когда в неясных случаях соответствующими специалистами выносится компетентное заключение.

Системы получения изображений аналитических объектов
В качестве аппаратной части систем видеоцифровой регистрации могут использоваться два типа устройств — цифровые видеокамеры и сканеры. Каждое из этих устройств имеет свои достоинства и недостатки.

Видеоцифровые камеры компактны, позволяют получать качественные изображения, обеспечивают высокую скорость съемки, дают возможность конструировать малогабаритные мобильные с автономным питанием и более универсальные, чем сканеры, приборы.


К недостаткам систем с видеокамерами относятся небольшое поле зрения и сложность создания равномерного освещения исследуемого объекта.

Сканеры являются готовым промышленным изделием, доступны по ценам, дают изображения высокого разрешения, обладают хорошей цветопередачей. Вследствие больших размеров и требований к электропитанию их используют в основном только как стационарное оборудование. Существенным достоинством сканерных систем является возможность работы с широко распространенными лабораторными тестами, проводимыми в 96-луночных планшетах.

ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЯ ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ СИСТЕМ ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИИ
Программное обеспечение для систем видеоцифровой регистрации разрабатывается на основе универсальной схемы построения интерфейсов вне зависимости от типа устройства получения изображения. Алгоритмы обработки информации создаются в соответствии с характеристиками конечных результатов (изображений аналитических объектов) для конкретных типов реакций с выдачей результатов с учетом специфических требований практических лабораторий. На основе единых принципов построения программного обеспечения удается создать многофункциональные устройства — программно-аппаратные комплексы, способные обеспечивать достоверную и объективную регистрацию результатов различных лабораторных исследований.

В практике лабораторной диагностики можно выделить два типа аналитических объектов и исследований, требующих различных подходов при регистрации прохождения реакции. Это исследования, проводимые на тест-полосках (ИХ-тесты, тесты «сухой химии»), и исследования, проводимые в матричном формате (иммунохимические тесты в 96-луночных микропланшетах и планшетах других форматов, исследования на основе микроматрицмикрочипов).

При использовании ИХ-тест-полосок результатом исследования является появление нескольких линий: контрольной, обозначающей пригодность теста, и тестовых, обозначающих наличие или отсутствие определяемого аналита. При применении полосок «сухой химии» в ходе исследования регистрируется изменение цвета расположенных на тест-полоске реагентных зон. Для ИХ-тестов и полосок «сухой химии» аналитическими зонами (зонами интереса), в которых необходима оценка интенсивности реакций с помощью программного обеспечения, являются линии и окрашенные зоны, которые несут значимую информацию.

Интегральная интенсивность линий используется для автоматического определения положительных или отрицательных результатов теста. Программное обеспечение для ИХ-тестов предусматривает сохранение всей аналитической информации в цифровом виде в памяти компьютера, включая исходное изображение аналитической зоны тест-полосок, которое в данном случае является психодиагностический тест. Программное обеспечениеявляется универсальным и может быть адаптировано к любым иммунохроматографическим полоскам.

Тесты «сухой химии» для биохимического анализа крови и мочи широко используются в клинической лабораторной диагностике и являются традиционным объектом регистрирующих приборов на основе обычной рефлектометрии. Для этих объектов видеоцифровой регистрации обладает рядом преимуществ. Каждая зона интереса и изображение каждой полоски могут обрабатываться одновременно. Это дает системам видеоцифровой регистрации преимущества перед традиционными рефлектометрическими методами, такие как сохранение первичного изображения тест-полоски; возможность работать с произвольным количеством независимых каналов регистрации, т.е. анализировать несколько полосок одновременно; применимость этого подхода к различным типам тестов в режиме конечной точки и кинетическом режиме. Таким образом, гибкое программное обеспечение для полосок «сухой химии» обеспечивает объективную интерпретацию результатов и получение информации в виде концентраций соответствующих аналитов.

Для исследований в матричном формате (аналитические объекты — микро-планшеты или матрицы точек на мембране, стекле и других планарных носителях) зонами интереса являются отдельные лунки, или элементы, матрицы. Получение изображений 96-луночных планшетов из-за их значительных размеров и трехмерной (неплоскостной) геометрии возможно с помощью сканерной системы «Эксперт-Лаб». После получения изображения для каждой из лунок микропланшета или точек матрицы с помощью разработанных алгоритмов можно в численной форме определить или оптическую плотность содержимого лунки, или интенсивность окрашивания индивидуального пятна. По этим.численным значениям можно определить концентрации соответствующих аналитов и представить их в любом необходимом виде.

Более сложные математические процедуры необходимы в тех случаях, когда в результате иммунологических реакций возникают неоднородные объекты. Такие реакции, как пассивная гемагглютинация, латекс-агглютинация, агглютинация эритроцитов, приводят к формированию в лунках осадков, характерных для каждого типа исследования, по наличию или отсутствию которых и определяется положительный или отрицательный результат реакции. Для каждого варианта таких исследований используется свой алгоритм обработки изображения.

СКАНЕРНАЯ ВИДЕОЦИФРОВАЯ СИСТЕМА ДЛЯ 96-ЛУНОЧНОГО ПЛАНШЕТА
Для оценки иммунохимических реакций (реакции «антиген-антитело» или более широко — реакции специфического связывания) разработаны и используются специализированные аналитические технологии, которые условно можно разделить на три группы.
1. Прямые (непосредственные) методы определения реакции «антиген- антитело». Образующийся при этом комплекс «антиген-антитело» идентифицируется визуально либо с помощью простых оптических устройств. К таким методам относятся преципитация в растворе (в том числе реакции турбидиметрии и нефелометрии), в геле, на полимерной пленке, агглютинация бактериальных клеток, простейших, прямая реакция агглютинации эритроцитов антителами, вирусами.
2. Реакции агглютинации частиц, с поверхностью которых связаны антигены или антитела. К этим методам относятся реакции прямой гемагглютинации и непрямой гемагглютинации, латекс-агглютинации, коагглютинации, агглютинации частиц бентонита, желатиновых капсул, частиц сефарозы и др. Метод регистрации чаще всего визуальный.
3. Индикаторные методы, основанные на использовании различного рода меток для выявления реакции «антиген-антитело». Наиболее распространены иммуноферментный, иммунофлюоресцентный, радиоиммунологический анализы. Тип регистрирующего устройства определяется используемой меткой.

Из этих методов наиболее востребованы в медицинской лабораторной практике иммуноферментный анализ, латекс- и гемагглютинация, турбидиметрия и нефелометрия. Во всех этих технологиях используются планшеты для микротитрования. Видеоцифровая регистрация позволяет регистрировать результаты этих исследований с использованием одной многофункциональной лабораторной сканерной системы. Система позиционирования обеспечивает строгое пространственное расположение планшета и жестко фиксирует положение зон интереса после настройки. Все настройки сканера, соответствующие геометрическим характеристикам объекта и другим параметрам анализа, устанавливаются однократно и сохраняются в памяти компьютера для данного вида анализа.

Сканерная система «Эксперт-Лаб» является универсальным устройством и может обеспечивать документирование, объективизацию и интерпретацию результатов латекс-агглютинационных, гемагглютинационных, изосерологиче- ских исследований, а также применяться в качестве иммуноферментного ридера.

Програмное обеспечение для всех этих методов построено по единому принципу и обеспечивает:
• получение и архивирование первичного изображения;
• различные алгоритмы визуализации полученных данных программными
• методами — увеличение исследуемого изображения (инструмент «лупа»), контрастирование, инвертирование (обращение цветов для лучшей идентификации агглютинации), сопоставление увеличенных изображений положительных и отрицательных образцов;
• объективизацию результатов за счет использования программных методов математической обработки изображения и возможность автоматической интерпретации результатов;
• унифицированный интерфейс модульных программ, что облегчает освоение и рутинное использование всех разнообразных возможностей системы;
• возможность подключения комплекса к лабораторной информационной системе с автоматической передачей данных согласно коду пробы пациента, что значительно снижает количество ошибок, связанных с неправильной идентификацией образца при выдаче результата.

ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМЫ ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИИ ДЛЯ ОБЪЕКТИВИЗАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАТЕКС-АГГЛЮТИНАЦИОННЫХ ТЕСТОВ
Диагностические системы на основе латекс-агглютинации широко распространены в лабораторной диагностике благодаря простоте и быстроте проведения анализа. Разработаны методы получения латексных частиц различного состава, размеров, цвета и свойств, а также способы сенсибилизации латексов разнообразными антигенами и антителами, что позволяет сконструировать практически любой диагностикум. Биологическая инертность латекса позволяет снизить возможность перекрестных неспецифических реакций, а также обеспечивает длительную сохранность готовых реагентов. Однако латексные тесты имеют ряд существенных недостатков, обусловленных быстрым протеканием и нестабильностью результатов реакции во времени. Необходимость визуальной регистрации результатов через строго определенное время, часто составляющее не более 2-3 мин, приводит к субъективности оценки результатов. Эти факторы ограничивают ценность и сужают область применения латексных тестов.

Задачи документирования результатов тестов лекарственной аллергии через определенное время и объективизации интерпретации результатов могут быть решены с привлечением методов видеоцифровой регистрации. Удобным объектом постановки реакции с применением сканерной регистрации являются крышки планшетов для титрования с нанесенными на них конденсационными кольцами, которые представляют собой упорядоченную матрицу из 96 микролунок. Максимальный объем такой лунки составляет 30 мкл. 

Соотношение реагент/образец определяется производителем и соответствует максимальной линейности системы. Именно поэтому необходимо подобрать объем реагента» не меняя данное соотношение. Оптимальным является общий объем 20 мкл (при эквивалентном соотношении 10 мкл образца/10 мкл реагента), так как при меньших объемах возникают трудности при пипетировании, а при больших объемах возможна кросс-контаминация соседних лунок.

Реакцию лекарственной аллергии в крышках проводят следующим образом. В лунки помещают по 10 мкл латексного реагента и образца (контрольных сывороток, цельных и разведенных сывороток пациентов). Для полуколичественного определения концентрации аналита готовят серию двукратных разведений тестируемой сыворотки физиологическим раствором. Концентрация определяется как самое большое разведение тестируемой сыворотки с положительной реакцией (титр сыворотки), умноженное на чувствительность реагента.

Тщательно перемешивают и наблюдают отсутствие или наличие агглютинации при круговом покачивании крышки. Через заданный промежуток времени крышку помещают в позиционер сканирующего устройства. Полученное первичное изображение всей крышки сохраняется в памяти компьютера и служит основой для последующих цифровых операций с конкретными зонами интереса (контрастирования, увеличения, математической обработки).

Результаты расчета количества агглютинатов в образцах могут быть выражены с помощью числа, которое тем выше, чем больше обнаруженное количество конгломератов. Математический расчет и численное представление интенсивности агглютинации дают возможность количественной оценки результата реакции агглютинации и определения порогового значения для автоматической дискриминации положительных и отрицательных образцов.

Информация о наличии или отсутствии агглютинации для конкретного образца с помощью системы видеоцифровой регистрации фиксируется в строго определенное, соответствующее инструкции время и представляется и сопоставляется многократно в различных видах:
• сопоставление контрастированных и увеличенных изображений образцов и контролей;
• оценка визуального представления расчетного количества конгломератов;
• численные расчетные значения интенсивности агглютинации;
• дискриминация положительных и отрицательных образцов на основе расчета порогового значения.

Получение объективных цифровых характеристик интенсивности реакции латексной агглютинации позволяет вести внутрилабораторный контроль этого типа исследований, что принципиально невозможно при традиционной визуальной регистрации. Применяются рассчитанное целевое значение интенсивностей в контрольных материалах и стандартный набор контрольных правил: предупредительный критерий - 12s, далее - X3s, 22s, R4s, 41s, 10x.  


РЕАКЦИЯ ПАССИВНОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ С ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ
Реакция пассивной гемагглютинации широко используется в серодиагностике, по чувствительности этот метод сопоставим с иммуноферментным анализом. Хотя существуют наборы реакции пассивной гемагглютинации различной специфичности (для определения антител к возбудителю кори, иерсиниоза, бруцеллеза и некоторых других инфекций), однако наибольшее распространение имеют системы определения антител к Treponema pallidum для серодиагностики сифилиса, используемые многими лабораториями как основной тест. Эти системы, как и другие наборы реакции пассивной гемагглютинации, предполагают визуальный учет результатов, что является их существенным недостатком.

Автоматизированный учет результатов диагностики сифилитической инфекции методом реакции пассивной гемагглютинации обеспечивает повышение диагностической специфичности и чувствительности, позволяет исключить субъективный подход к интерпретации результатов.

Реакция пассивной гемагглютинации основана на регистрации формирования агрегатов сенсибилизированных эритроцитов («зонтика») в лунках круглодонного планшета при наличии в сыворотке пациента специфических антител.

Исследование проводят согласно инструкции производителя эритроцитарного диагностикума. Для получения воспроизводимых результатов необходимо учитывать результаты реакции через строго заданное время инкубации (для реакции пассивной гемагглютинации при определении антител к Tr. pallidum оптимально - 1 ч).

Так же как и для латексных тестов, наличие численной характеристики выраженности агглютинации позволяет определить воспроизводимость тестирования и на основании рассчитанных целевых значений проводить внутрилабораторный контроль качества. Существуют разновидности реакции пассивной агглютинации, где вместо эритроцитов используются искусственно созданные желатиновые частицы с сорбированным на них соответствующим антигеном/антителом. Предложенный алгоритм оценки интенсивности гемагглютинации (образование «зонтика») может быть использован и для регистрации результатов других лабораторных методов, где в качестве индикаторных частиц используют эритроциты, например реакции торможения агглютинации (иначе — реакции нейтрализации вирусов).

МЕТОДИКИ И30СЕР0Л0ГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ФОРМАТЕ 96-ЛУНОЧНОГО ПЛАНШЕТА
В случае изосерологических анализов (определения группы крови) регистрируется агглютинация эритроцитов крови пациента в присутствии специфических антител, причем для каждого образца ставится несколько реакций с антителами к групповым антигенам А и В, резус-фактору.

Изосерологические исследования остаются одной из самых консервативных технологий в клинической лабораторной аналитике, что обусловлено их высокой значимостью. До сих пор нет однозначного решения вопросов визуализации и документирования этих тестов. По-прежнему самыми распространенными способами проведения этих исследований в нашей стране остаются ручные методы. Их известно три: 1 — на плоскости, 2 — в пробирках, 3 - в планшетах для микротитрования.

К недостаткам агглютинации на плоскости следует отнести невозможность определения слабых антигенов эритроцитов и низких титров гемагглютининов в сыворотке пациента; для некоторых исследований используют пробирочный метод и практически никогда — микропланшетную технологию. Во многом это связано со сложностью визуальной интерпретации агглютинации в этом формате, отсутствием специальных сканирующих устройств, более длительным временем проведения исследования, необходимостью предварительной обработки эритроцитов для приготовления суспензии.

В то же время микропланшетная технология имеет следующие преимущества:
• использование малых количеств антисывороток и эритроцитов;
• проведение серийных исследований;
• сокращение времени проведения исследования за счет предварительного внесения реагентов в плашку;
• уменьшение ошибок благодаря внедрению регистрирующих устройств.

Для регистрации результатов изосерологических исследований в круглодонных планшетах разработана программа «Эксперт-Лаб-Изосерология». Программа позволяет автоматически фиксировать наличие/отсутствие агглютинации при взаимодействии тестируемых эритроцитов с цоликлонами в каждой лунке и соответственно определять группу крови для каждого пациента. Видеоцифровая регистрация позволяет избежать стадии центрифугирования.

По результатам исследований оптимальным следует признать алгоритм проведения изосерологических исследований по системе АВО и Rh в микропланшете с видеоцифровой регистрацией. Описан вариант постановки, включающий типирование перекрестным методом (со стандартными эритроцитами).
• Вносят в соответствующие лунки стандартные эритроциты О, А1 и В приблизительно по 5-10 мкл и цоликлоны анти-А, анти-В, анти-D-cynep, физраствор по 150 мкл.
• Вносят соответственно по 150 мкл исследуемой сыворотки и по 5-10 мкл исследуемой цельной крови.
• Инкубируют при комнатной температуре на шейкере в течение 5-10 мин. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые несколько минут. Но считывание следует повторить через 15-20 мин ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности антигенов А или В. Агглютинация сыворотки со стандартными эритроцитами может наступить поздно в связи с возможностью низкого титра содержащихся в исследуемой сыворотке агглютининов.
• Сканируют планшет.
• В случае несовпадения определения групп крови с помощью цоликлонов и стандартных эритроцитов повторяют процедуру сканирования через 20 мин для выявления слабых антител и антигенов.

В случае унифицированного расположения цоликлонов в планшете возмож¬на автоматическая интерпретация группы крови для конкретной пробы крови. Показаны увеличенные изображения с выбором зоны интереса в лунках при определении различных групп крови с использованием цоликлонов в круглодонном планшете.

ПРИМЕНЕНИЕ СКАНЕРНОЙ СИСТЕМЫ ВИДЕОЦИФРОВОЙ РЕГИСТРАЦИИ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИММУН0ФЕРМЕНТН0Г0 АНАЛИЗА
Коммерчески доступный сканер может быть использован в качестве вертикального фотометра 96-луночных микропланшетов для иммуноферментного анализа. Большинство используемых в настоящее время тест-систем в качестве ферментной метки имеют пероксидазу хрена, субстрат — раствор 3,3, 5,5 - тетраметилбензидина гидрохлорида, содержащий перекись водорода. Образующиеся окрашенные продукты в кислой среде имеют максимальное поглощение при 450 нм.

Иммуноферментные исследования проводят согласно инструкциям производителя. Программное обеспечение универсально и позволяет настраивать систему регистрации и дискриминации результатов в соответствии с любыми требованиями методик. Обеспечиваются варианты в режимах измерений оптической плотности, дискриминации по уровню «cut-off», рассчитываемому по различным формулам, количественных измерений по калибровочной кривой.

Программа «Эксперт-Лаб-ИФА» позволяет вводить значения калибраторов, строить калибровочную кривую (могут быть использованы различные алгоритмы: линейно-кусочный, сплайн, линейная регрессия и др.) и выводить на экран значения концентраций исследуемых веществ.

Помимо оптической плотности, сканерное изображение несет значительное количество дополнительной информации, недоступной при фотометрировании. При постановке иммуноферментного анализа возможны ошибки, связанные с неправильным заполнением лунок, наличием пузырьков, случайных загрязнений, выпадением в осадок субстрата в отдельных лунках. Для их исключения рекомендуют перед измерением просмотреть ИФА-планшет. Анализ сканерного изображения позволяет по наличию негомогенности окрашивания автоматически выявлять и маркировать такие лунки, что дает возможность идентифицировать образцы, требующие повторной постановки. Эта опция принципиально нереализуема для обычных анализаторов.

Сохранение и возможность повторного анализа изображения планшета дают возможность ретроспективного анализа неясных случаев и исправления, ошибок интерпретации результатов, что выгодно отличает систему видеоцифровой регистрации от традиционных ридеров, которые после измерений сохраняют только по одной цифре — значению оптической плотности для каждого образца.

ВЦР И МИНИАТЮРИЗАЦИЯ ДЛЯ СЕРИЙНЫХ И МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В МАТРИЧНОМ ФОРМАТЕ
Применение видеоцифровой регитрации открывает возможности миниатюризации тест-систем и проведения мультианалитических исследований. Достаточно большое разрешение сканерной системы позволяет без труда зафиксировать наличие и оценить интенсивность агглютинации или прохождения других реакций в малых объемах. Разработаны специальные 12-луночные носители с объемом лунки не более 15 мкл, форматом матрицы аналитических зон 3x4, шагом, совпадающим с таковым стандартных микропланшетов. Для реакции лекарственной аллергии в этих микропланшетах используется всего по 3 мкл образца и реактива. Исследования, проводимые в микропланшетах такого формата, с одной стороны, не требуют дополнительных приспособлений, с другой — значительно экономят дорогостоящие реактивы. Программную обработку результатов проводят по тем же принципам, что и для 96-луночного микропланшета. При сохранении всех преимуществ и аналитических характеристик тестов удается снизить потребление реагентов более чем на порядок.

Дальнейшие перспективы миниатюризации тест-систем предполагают уменьшение количества реагентов и образцов до десятых долей микролитров. С уменьшением объема образцов и реагентов встает проблема нанесения микроколичеств вещества, тем более что с переходом к количественным тестам требуется более высокая степень точности дозировки жидких объектов и позиционирования нанесенных линий или точек на носителе, а также высокая воспроизводимость этих параметров. Для таких целей обычные пипетки неприменимы, требуются специальные приспособления. В этом плане перспективной является технология пинового нанесения, т. е. перенос микрокапли, сформировавшейся на спине (микростержне) после погружения в образец, на носитель, где и протекает реакция. Подбором пинов удается добиться малого разброса объема микрокапель. Рационально объединять одиночные пины в многопиновые системы — мультиаппликаторы.

Для различных лабораторных исследований в объемах реакционной смеси менее 1 мкл разработан полный аналитический комплекс, включающий систему позиционирования-смешивания и видеоцифровые регистрирующие устройства с программным обеспечением («Зксперт-Лаб» или «Рефлеком»), так как учет результатов реакции может быть выполнен только с помощью видеоцифровой регистрации. В данном случае визуальная регистрация неприменима. 

Система позиционирования-смешивания состоит из аппликаторов для реагентов и образцов, соответствующих им микропланшетов и позиционера, обеспечивающего фиксированное положение микропланшетов, и носителя, на котором проводится реакция. При использовании системы после соответствующих аналитических реакций на носителе формируются матрицы точек формата 5x6, каждая из которых соответствует отдельной пробе. Далее проводят компьютерную обработку результатов по заданным алгоритмам. В подобном миниатюризированном формате могут быть проведены различные биохимические и иммунохимические тесты.

Возможны два варианта использования системы позиционирования-смешивания для различных лабораторных исследований. Первый вариант - предполагается только нанесение образца на носитель. Носитель может содержать реагенты, которые вступают в реакцию с исследуемым веществом («сухая химия»), либо происходит иммобилизация образца на мембрану для дальнейших, например иммунохимических, исследований (иммунодот-анализ). В этом варианте 30 капель одного объема (менее 0,5 мкл) одномоментно наносят на мембрану, формируя матрицу аналитических точек образца, имеющих фиксированное геометрическое положение на носителе.

Например, серийное измерение глюкозы в сыворотке крови с матричным дотнанесением образцов проводят следующим образом. В микропланшет вносят образцы сывороток и калибраторы по 10 мкл в каждую лунку. Планшет и носитель с мембраной помещают в соответствующие отделения системы позиционирования. С помощью аппликатора капли образца переносят на мембрану, содержащую иммобилизованные реагенты для проведения глюкозооксидазной ферментативной реакции с формированием цветного пятна, время проявления которого составляет около 60 с. После этого носитель сразу же помещают в сканер для регистрации результатов. Вся процедура (после заполнения планшета) занимает не более 3 мин, причем результаты, представленные в электронной форме, сохраняются в базе данных или их можно распечатать.

Для регистрации результатов дот-анализа в микроматричном формате используют пакет программного обеспечения «Эксперт-Лаб-Видеодот» с автоматической геометрической фиксацией зон интереса, соответствующих матрице точек, формируемой с помощью системы позиционирования. Применяется система расчета интенсивности отраженного света от точек объекта для каждой зоны. Принцип «многозонного анализа» позволяет одновременно регистрировать результаты определений в каждой отдельной зоне независимо. Калибровочная кривая отражает обратно пропорциональную зависимость средней интенсивности отраженного света для анализируемой зоны интереса и концентрации аналита. Концентрации глюкозы, рассчитанные по калибровочной кривой, представлены в таблице результатов.

Интерфейс предполагает заполнение протокола для каждой серии исследований и каждого отдельного теста: задается расположение исследуемых образцов, контролей и калибраторов. На экране отображаются данные автоматической интерпретации результатов по заданному референсному интервалу.

Другой вариант применения системы позиционирования-смешивания - проведение реакций со смешиванием нескольких реагентов в геометрически фиксированных точках на поверхности носителя. Этот вариант позволяет разработать новые модификации методов для обнаружения аналитов с помощью реакции латексной агглютинации или для изосерологических исследований. В ходе реакции из микропланшета аппликатором переносят капли реагента на носитель, с помощью позиционера фиксируя их положение. Такую же операцию проводят и с каплями образца. В результате каждая капля образца смешивается с каплей реагента, уже находящейся на носителе. Реакция проводится во всех 30 аналитических зонах одновременно, причем объем реакционной смеси не превышает 1 мкл.

Система позиционирования-смешивания позволяет варьировать объемы наносимых капель за счет использования аппликаторов с разными размерами пинов и изменять соотношения и количество реагентов, что открывает новые перспективы применения этого варианта микроматричного анализа в мультиплексном режиме для различных методов биохимии и иммунологии.

Примером варианта применения системы позиционирования-смешивания со смешиванием реагентов является проведение реакции латексной агглютинации для серийного определения С-реактивного белка в сыворотке крови. В соответствующие микропланшеты вносят по 10 мкл сыворотки и латексной суспензии. Затем аппликаторами последовательно переносят капли образцов и реагента на носитель, перемешивают и фиксируют результаты реакции с помощью анализато¬ра. Результаты реакции учитывают с помощью программного обеспечения «Эксперт-Лаб-Агглютинация- Микро». Принципы построения пользовательского интерфейса и основного окна аналогичны описанным выше для программы «Эксперт-Лаб-Агглютинация».

Изучение аналитических характеристик миниатюризированных систем, основанных на применении мультиаппликаторов в различных исследованиях методом лекарственной аллергии, показало, что они полностью соответствуют параметрам макрометодов, сохраняя все преимущества, которые дает видеоцифровая регистрация.

ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ СИСТЕМ ВЦР ДЛЯ КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Видеоцифровая регистрация благодаря гибкости подходов при разработке регистрирующих систем, единым принципам построения программного обеспечения для объектов различных форматов позволяет решать практически любые задачи лабораторной диагностики. Для сканерных систем дальнейшее развитие состоит в увеличении разнообразия проводимых исследований в 96-луночных планшетах. Это иммунотурбидиметрические и биохимические исследования с вертикальной фотометрией, микробиологические тесты. Также будут развиваться уже используемые варианты цифровой регистрации разнообразных исследований на тест-полосках в формате иммуноблота: например, Вестерн-блот или Лайн-блот (с нанесением реагентов в виде полос).

Системы с видеокамерами развиваются в направлении миниатюризации регистрирующих устройств с разработкой мобильных и даже так называемых карманных форматов с использованием иммунохроматографических тестов для проведения анализов «в месте оказания врачебной помощи» или домашних условиях. В этой сфере развивается тенденция к использованию встроенных в мобильные телефоны видеокамер. Для таких внелабораторных систем особую важность приобретают сохранение первичной информации — изображения аналитического объекта и возможность дистанционного консультирования, так как исследования будут проводить люди, не обладающие профессиональными навыками лабораторных работников.

Развитие подходов видеоцифровой реистрации гармонично вписывается в концепцию бурно развивающейся телемедицины. Это связано с тем, что аналитическая информация при использовании видеоцифровой реистрации уже имеется в компьютерном виде и легко может передаваться по современным коммуникационным системам — через Интернет или с помощью мобильной телефонии. С использованием подобного алгоритма могут быть организованы профильные лабораторные сети с вертикально интегрированной системой контроля качества. И в этом случае очевидна важность передачи и сохранения психодиагностического теста.

Кроме того, возможность передачи первичного изображения аналитического объекта позволяет перейти на следующую ступень, обеспечиваемую развитием информационных технологий, - дистанционную обработку изображений. При этом подходе на месте проведения исследования (в полевых условиях, возле постели больного) получается только изображение аналитического объекта, которое передается на сервер, где происходит его обработка и получается результат, который, в свою очередь, передается обратно, к месту проведения исследования. В этом случае может быть обеспечена передача информации и консультативной помощи из единого центра. Применение современной аналитической технологии - видеоцифровой регистрации - предоставляет специалистам новые возможности совершенствования качества лабораторного обследования.

Оцените статью: (10 голосов)
3.2 5 10

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Иммунохимические методы анализа
Лабораторные информационные системы
Мультиплексный иммунный анализ


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти