MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Возможности проточной цитометрии

Проточная цитометрия - высокотехнологичный метод быстрого измерения характеристик клеток. Проточная цитометрия основывается на арсенале флюоресцентных методов анализа структурных компонентов клеток, их антигенов и внутриклеточных процессов. Этим методом исследуются выборки от нескольких тысяч до нескольких миллионов клеток, что гарантирует статистическую достоверность результатов. В свою очередь, от классической биохимии и молекулярной биологии цитометрию отличает возможность анализировать не усредненные молекулярные характеристики по всей популяции, а индивидуальные параметры для каждой клетки. Созданная для ускорения анализа в клинической цитологии и цитодиагностике, эта технология постепенно развилась в эффективный подход к решению многих важных задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии и т.


д. В клинической практике наиболее часто проточную цитометрию используют для исследования клеток крови и костного мозга, их антигенного состава, функциональной активности, количества ДНК и РНК, определения уровня продукции цитокинов.

Существуют два направления: проточная цитометрия и проточная цитометрия-сортировка. Первое представляет аналитический подход, второе позволяет отобрать интересующие исследователя субпопуляции клеток, основываясь на аналитических возможностях первого, и в дальнейшем проводить работу с отобранными субпопуляциями. В последнее время позиции проточных цитометров как сортировщиков поколебались за счет появления магнитной сепарации, но целый ряд научных исследований невозможен без их использования. К таким исследованиям можно отнести сортировку индивидуальных хромосом, получение тетраном и др.

Две существенные особенности проточной цитометрии делают этот метод особенно ценным для клинической практики.


Во-первых, этот метод позволяет охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу, а при использовании ДНК-цитометрии - и по генотипу входящих в них клеток. Анализы такого рода служат для выявления отклонений, происходящих в процессе онкогенеза. Большинство современных применений цитометрии связано с анализами именно такого рода. Во-вторых, это возможность обнаружить и охарактеризовать редкие события, т. е. встречающиеся с частотой 10-5-10-7, что стало возможным благодаря огромной производительности. Современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 10 тыс. клеток в секунду.

Области применения проточной цитометрии сегодня весьма разнообразны. Первоначально интенсивно развивались способы количественного анализа внутриклеточных компонентов, таких как ДНК и РНК. Работа в данном направлении привела к созданию методов анализа параметров клеточного цикла. В свою очередь, это послужило фундаментом для разработки методик анализа делящихся клеток и клеток с аномальным содержанием ДНК. Информация, извлекаемая из сигналов светорассеяния и измерения времени пролета клеток через зону анализа, позволила судить о морфологических характеристиках клеток (размере, соотношении размеров ядра и цитоплазмы, гранулярности цитоплазмы, степени асимметрии клеток).

Развитие гибридомной технологии привело к тому, что появился такой инструмент, как моноклональные антитела. Моноклональные антитела предоставили возможность типировать клетки не только по морфологическим различиям, но и за счет набора поверхностных антигенов и рецепторов, характерных для строго определенных клеток и их функционального состояния. В различных лабораториях мира были получены моноклональные антитела к одним и тем же антигенам, авторы присвоили им свои собственные названия. Это привело к тому, что возникла путаница, исследователи говорили об одних и тех же антигенах клеточной поверхности, но называли их по-разному. Во избежание этого в начале 1980-х гг. было созвано Международное рабочее совещание по антигенам лейкоцитов человека и предложено объединить моноклональные антитела в группы, или кластеры, исходя из того, какую антигенную структуру на клеточной поверхности они распознают. Таким образом, первоначальный смысл понятия «кластер дифференцировки» — это набор моноклональных антител, которые распознают одну и ту же структуру на клеточной поверхности независимо от эпитопной специфичности. Со временем это понятие видоизменилось, и многие исследователи понимают под CD саму структуру на клеточной поверхности. Исходя из изложенного выше становится понятно, что для эффективного использования моноклональных антител должны быть кластеризованы, т. е. внесены в реестр известных моноклональных антител и отнесены к определенному кластеру дифференцировки. Для этого каждые моноклональные антитела должны пройти проверку в нескольких независимых лабораториях, где должно быть показано, что они взаимодействуют с определенными клетками и распознают определенную структуру на их поверхности. В настоящее время известно более 350 основных кластеров дифференцировки клеток человека. Использование моноклональных антител изменило подходы к иммунофенотипированию клеток. Меченные флюорохромами моноклональных антител позволяют проводить как качественный, так и количественный анализ поверхностных и внутриклеточных антигенов.

Как отдельное направление развивается исследование активности внутриклеточных ферментов. Это направление получило название «проточная цитоэнзимология». Разработан ряд реагентов, представляющих собой синтетические субстраты для измерения активности внутриклеточных ферментов. Новые флюорогенные субстраты позволяют оценить активность большего количества ферментов по сравнению с доступными ранее субстратами. Преимущество данного подхода в том, что при сопоставлении уровня активности ферментов нормальных клеток с уровнем активности клеток, вовлеченных в патологический процесс, могут быть обнаружены различия, позволяющие идентифицировать поврежденные клетки и исследовать процессы, протекающие в них.

Сочетание различных флюорохромов сделало возможным количественное и качественное исследование таких физиологических внутриклеточных параметров, как pH (флюоресцеин и 7-гидроксикумарин), концентрация свободных ионов кальция (Fura-2, Indo-1, Fluo-З), уровень окислительных процессов, активация митохондрий, потенциал наружной мембраны клеток, процессы, связанные с апоптозом, и т. д. Достижения в различных областях молекулярной биологии, биохимии и медицины позволяют изучать с помощью проточной цитометрии содержание секретируемых цитокинов в сыворотке крови с помощью мультиплексного анализа, локализацию антигенспецифичных клонов клеток с помощью тетрамер. Существуют методы, позволяющие с помощью проточной цитометрии измерять функциональные показатели, такие как фагоцитарная активность, апоптоз, экспрессия цитокинов и др. Все это создает предпосылки для современных исследований всего комплекса внутриклеточных процессов на уровне отдельных клеток. 

Современные проточные цитометры обладают высокой чувствительностью и высоким уровнем автоматизации, простотой эксплуатации и имеют небольшие размеры — все это позволяет рассматривать их не только как исследовательские, но и как клинико-диагностические инструменты.

Оцените статью: (12 голосов)
3.92 5 12

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Аналитические характеристики проточной цитофлюориметрии
Ограничения проточной цитометрии
Основы проточной цитофлюориметрии
Оценка клеточного звена иммунитета
Преимущества проточной цитофлюориметрии


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти