MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Основы проточной цитофлюориметрии

фото Основы проточной цитофлюориметрии
В основе проточной цитофлюориметрни лежат фотометрические и флюоресцентные измерения отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света.

Методом проточной цитометрии можно измерять следующие параметры.
• Рассеяние света под малыми углами (1-19°). Этот параметр используют для определения размеров клеток.
• Рассеяние света под углом 90°. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также о неоднородности или гранулярности цитоплазмы.
• С помощью флюоресцентных каналов изучают клеточные маркеры, для чего используют моноклональные антитела к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток, меченные различными флюорохромными красителями.
• Интенсивность флюоресценции изучаемого объекта может служить количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность рецепторов) на клетках.
• Проточные цитофлюориметры оборудованы несколькими фотоэлектронными умножителями, что позволяет одновременно регистрировать несколько типов флюоресценции.
• Существует возможность измерять поляризацию флюоресценции и время прохождения частицы через зону анализа.


Первое позволяет исследователю судить о степени вязкости мембран клеток, которая меняется в зависимости от их функционального состояния, а второе — о степени асимметричности клеток или исследуемых органелл.

Фотометрические каналы используются для оценки размеров клетки и внутриклеточных структур. Частицы, отличающиеся по размеру, по-разному рассеивают свет, при этом характер рассеивания зависит от соотношения длины волны света и диаметра частиц. В том случае, когда длина волны облучения сопоставима с размерами частиц, характер рассеивания меняется, световая волна огибает частицу, взаимодействует с ней и отклоняется от прямолинейного распространения на небольшой угол — малоугловое (1-19°) или прямое (FS или FSC) светорассеяние. Такой тип рассеяния при взаимодействии света с поверхностью клеток позволяет оценить их размер.

Если размер частиц меньше длины волны облучающего монохроматического света лазера (например, внутриклеточные структуры), существенное количество света рассеивается под углом 90° (боковое светорассеяние, SS или SSC).

При одновременной регистрации бокового и прямого светорассеяния можно выделить все клеточные популяции лейкоцитов.


В этом случае удается определить физические свойства каждой неокрашенной клетки (размер и сложность структуры), таким образом разделить анализируемую клеточную популяцию на отдельные субпопуляции.

Основной формой отображения результатов в процессе накопления данных являются двухпараметрические гистограммы распределения. Чаще всего именно на гистограммах отмечается гейт (от англ. gate — ворота). Гейт — это логическое ограничение, используемое для селекции событий при анализе по нескольким скоррелированным параметрам. Параметры клеток, попавших внутрь отмеченного гейта, будут отображаться на других гистограммах и цитограммах, а данные о клетках, не попавших в гейт, будут проигнорированы.

Флюоресцентные каналы применяют для изучения клеточных маркеров, для чего используют моноклональные антитела, меченные различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток. После окрашивания клеток моноклональных антител происходят специфическое связывание последних с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуцированной излучением лазера. Техника регистрации состоит в следующем. При облучении меченых клеток лазером с длиной волны, возбуждающей флюорохром, происходит поглощение света. Затем флюорохром испускает свет, но уже меньшей интенсивности (большей длины волны), чем поглощенный. Кроме того, флюорохром испускает свет во все стороны, поэтому флюоресценцию можно регистрировать под любым углом по отношению к облучаемому свету. Как правило, регистрацию проводят под прямым углом, однако для монохроматического лазерного облучения это не является обязательным условием, так как испускаемый флюоресцентный сигнал всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет лазерного облучения. В проточной цитофлюориметрни применяют множество флюоресцентных красителей. Моноклональные антитела, меченные различными флюорохромами, различаются как по специфичности их молекулярного связывания, так и по оптическим характеристикам: по спектрам поглощения и соответственно возбуждения флюоресценции, величинам молекулярных коэффициентов экстинкции, спектрам и квантовым выходам флюоресценции. В зависимости от того, какими лазерами укомплектован прибор, подбирают флюоресцентные красители.

Количественный анализ интенсивности иммунофлюоресценции служит для точного подсчета количества определенных молекул внутри клетки или на ее поверхности. Разработана группа методов, основанных на детекции исследуемых молекул с помощью меченых моноклональных антител. Количественный анализ некоторых маркеров раскрывает полезную клиническую информацию. Например, опухолевые клетки, относящиеся к предшественникам В-лимфоцитов, можно дифференцировать от нормальных предшественников и зрелых В-лимфоцитов по высокой плотности экспрессии CD 10 или CD 38 соответственно и низкой экспрессии CD 24 и CD 45; высокая экспрессия CD 10 клетками острого В-клеточного лимфобластного лейкоза является полезным признаком для выявления минимальной остаточной болезни. Количественный анализ флюоресценции — косвенная мера определения количества антигенных структур, способных связаться с определенным меченым антителом. Калибровка интенсивности флюоресценции связывает интенсивность сигнала флюоресценции с количеством меченых моноклональных антител, присоединившихся к клетке.

Учитывая, что интенсивность флюоресценции от каждой конкретной клетки зависит от количества меченых моноклональных антител, связавшихся со специфическими антигенами на поверхности лимфоцитов, средняя интенсивность флюоресценции популяции клеток может служить количественным критерием, характеризующим экспрессию антигенов (плотность рецепторов) на клетках.

С помощью современных проточных цитофлюориметров можно одновременно измерить спектр эмиссии до десяти различных флюорохромов. Результаты измерений по каналам флюоресценции, как правило, отображаются в виде двухпараметрических гистограмм. При анализе двухпараметрического графика по каналам флюоресценции оценивают процент клеток, несущих тот или иной маркер, одновременную экспрессию на клетках двух и более различных антигенов, а также по средней интенсивности флюоресценции меченых антител, соединенных с клеткой, можно судить о плотности экспрессии клеточных антигенов.

Оцените статью: (11 голосов)
4.36 5 11

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Аналитические характеристики проточной цитофлюориметрии
Возможности проточной цитометрии
Ограничения проточной цитометрии
Оценка клеточного звена иммунитета
Преимущества проточной цитофлюориметрии


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти