MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Проточная цитометрия для исследования функциональных особенностей клеток иммунной системы

фото Проточная цитометрия для исследования функциональных особенностей клеток иммунной системы
Клеткам иммунной системы присущи определенные функции, которые они выполняют в ответ на внешние раздражители. Наличие или отсутствие такого ответа может о многом сказать специалисту, например нейтрофилы как эффекторы играют важную роль в неспецифическом иммунном ответе для обеспечения резистентности организма, индуцируют и регулируют деятельность различных клеток иммунной системы. Нарушение фагоцитарной активности как одной из основных функциональных характеристик нейтрофилов является индикатором снижения устойчивости организма к инфекционным заболеваниям.

Наиболее часто используемые приложения метода проточной цитометрии для данного рода исследований — измерение фагоцитарной и бактерицидной активности нейтрофилов, мониторинг септического состояния пациентов, измерение количества клеток, находящихся на различных стадиях программируемой клеточной гибели, а также определение пролиферативной активности клеток.

Определение фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов.


Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов может стать результатом разнообразных клинических расстройств. Известны врожденные дефекты, такие как дисфункция актина и дефицит рецептора комплемента C3bi. В результате сниженного фагоцитоза нейтрофилов эти дефекты могут привести к повышенной восприимчивости к инфекциям. Приобретенные дефекты, связанные с изменением фагоцитарной активности, обнаруживают при травмах, сахарном диабете, почечной недостаточности и инфекциях. Так, снижение фагоцитарной активности было обнаружено у пациентов с текущими бактериальными инфекциями кожи и легочного синуса, при инфицировании ран от ожогов, у пациентов со СПИДом.

Процесс фагоцитоза разделяют на несколько стадий: хемотаксис (перемещение фагоцитов к воспаленным участкам), адгезию (прилипание частиц к поверхности фагоцитов), собственно фагоцитоз и внутриклеточное уничтожение фагоцитированных объектов.


Использование метода проточной цитометрии и флюоресцентно меченных частиц (бактерий, дрожжей, латексных частиц) для измерения стадии собственно фагоцитоза значительно облегчило анализ этой важной функции нейтрофилов. Однако данный метод не обеспечивал регистрацию различий между частицами, находящимися внутри клеток, и теми частицами, которые могли прикрепиться к их поверхности. Эту проблему удалось преодолеть путем подавления флюоресценции прикрепившихся снаружи частиц за счет использования витальных красителей, таких как трипановый синий и кристаллический фиолетовый.

Анализ кислородного взрыва. Нейтрофилы играют важную роль в неспецифическом иммунном ответе и резистентности организма, нейтрализуя чужеродные объекты. Поглощенные микроорганизмы уничтожаются за счет как зависимых, так и не зависимых от кислорода механизмов. Свободные радикалы кислорода убивают поглощенные бактерии в фагосомах и частично высвобождаются в окружающую среду, с одной стороны, усиливая уничтожение микроорганизмов, а с другой — повреждая окружающие ткани. Этот эффект получил название окислительного, или кислородного, взрыва. Данный процесс усиленно протекает при остром воспалении и в меньшей степени при хроническом течении болезни. Уничтожение микроорганизмов также возможно за счет белков в азурофильных гранулах, таких как катепсин G, лизоцим, интерфероны и др.

Снижение или отсутствие кислородного взрыва наблюдается при врожденных дефектах, например хроническом гранулематозе. Данное заболевание обычно проявляется в течение первых двух лет жизни и характеризуется клинически повторяющимися и опасными для жизни инфекциями, вызванными бактериальными и грибковыми микроорганизмами. Эти инфекции клинически проявляются как пневмоний, лимфадениты или абсцессы, которые затрагивают лимфатические узлы, легкие и печень. Одну из ведущих ролей при этом играет НАДФН+-оксидаза, которая представляет собой систему ферментов, ответственных за продукцию супероксид-анионов, которые быстро преобразуются в перекись водорода и гидроксильные радикалы. Нарушения структуры основных пептидов НАДФН+- оксидазы являются главной причиной дисфункций при хроническом гранулематозе, так как нейтрофилы у данных пациентов не могут осуществить значительный окислительный взрыв после активации. Данные нарушения наблюдаются также при трансплантациях и у пациентов со СПИДом.

Коммерческие наборы для измерения кислородного взрыва, так же как и для измерения фагоцитарной активности, присутствуют на рынке. Процедура измерения фагоцитоза представляет собой многоэтапный и многофакторный процесс, специалист должен контролировать его на всех этапах. Высокая производительность современных цитометров и большие выборки анализируемых клеток делают этот метод более достоверным по сравнению с микроскопией.

Мониторинг септического состояния. Достаточно часто нарушения фагоцитарной активности и окислительного взрыва наблюдаются при септическом шоке. Исследование его патогенеза все более сосредоточивается на роли иммунной системы, поскольку изменения ее функций являются главным фактором риска для развития серьезных инфекций у пациентов, которые подвергались хирургическому вмешательству. Так, многочисленные отклонения механизмов иммунной защиты возникают у тяжелобольных пациентов в послеоперационном периоде. К ним относятся понижение экспрессии макрофагами антигенов главного комплекса гистосовместимости класса II (HLA-DR), измененная активация Т-клеток, пониженный хемотаксис и фагоцитоз нейтрофилов. Данные нарушения были описаны также при раневой инфекции и травмах. Снижение экспрессии HLA-DR связывают с усилением продукции IL-10, поскольку сыворотка пациентов с сепсисом снижает экспрессию HLA-DR, а моноклональные антитела к IL-10 блокируют этот эффект. Активно влияют на снижение экспрессии HLA- DR-антигенов и глюкокортикоиды. Таким образом, снижение экспрессии моноцитами HLA-DR-антигенов, которые играют критическую роль в представлении антигена Т-хелперам, является признаком развивающейся инфекции в послеоперационном периоде, а анализ экспрессии HLA-DR в течение первых двух дней после операции может служить основанием для применения более раннего тера-певтического вмешательства.

Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что пациенты с низкой экспрессией HLA-DR на моноцитах должны получать терапию с использованием иммуномодуляторов, таких как интерферон растворы, обогащенные глутамином, гликопептиды, содержащие мурамил, и другие препараты для стимуляции иммунной системы. Все перечисленные выше данные привели к тому, что была предложена методика мониторинга септического состояния пациентов с открытыми травмами в послеоперационном периоде.

Принцип оценки септического состояния заключается в измерении экспрессии HLA-DR-антигенов на поверхности моноцитов, для этого используют цельную периферическую кровь. Анализ проводят на двух окрашенных образцах, один из которых является контрольным. Для локализации моноцитов применяют CD14, рецептор эндотоксина липополисахарид (LPS), являющийся одним из основных маркеров для моноцитов. Экспрессию HLA-DR измеряют с помощью многопараметрического анализа и сравнивают с контрольным образцом, где вместо моноклональных антител к HLA-DR применяют неспецифические антитела того же изотипа. 

Критерием оценки состояния пациента при сепсисе служит относительное количество моноцитов, экспрессирующих HLA-DR; прогноз благоприятен, если количество позитивных клеток превышает 40% на 5-й день после госпитализации и проведения соответствующей терапии. Данный критерий был получен на госпитализированных пациентах с септическим шоком. В первые 48 ч госпитализации экспрессия HLA-DR на моноцитах значительно снижена у пациентов с сепсисом (25±4%) по сравнению со здоровыми донорами (89+1%). Экспрессия HLA-DR на моноцитах выживших пациентов в первые 48 ч после госпитализации не отличается от этого показателя у больных, впоследствии погибших. Однако экспрессия HLA-DR на моноцитах у оставшихся в живых пациентов на 5-й день госпитализации более выраженная (выше 40%), что свидетельствует о восстановлении иммунного статуса.

Таким образом, в период разгара септического состояния более 50% популяции моноцитов не экспрессируют HLA-DR-молекулы на своей поверхности. В период клинической ремиссии заболевания экспрессия данных молекул восстанавливается практически до нормальных значений. Данный показатель может служить дополнительным критерием диагностики сепсиса и оценки эффективности проводимых лечебных мероприятий. Процедура оценки дефекта презентации антигена доступна для использования практически в любой клинической лаборатории, оборудованной проточным цитометром.

Таким образом, использование метода проточной цитометрии для оценки функционального состояния фагоцитов, включая их отдельные субпопуляции, не имеет технических препятствий в клинической практике. Метод применим для оценки функций клеток при различных патологиях, в основе которых лежат механизмы нарушения фагоцитоза.

Оценка апоптоза методом проточной цитометрии. Апоптоз является про-явлением физиологического процесса - генетически запрограммированной клеточной смерти, естественной, закономерной. Апоптоз включает несколько этапов: во-первых, получение клеткой экзогенного (внешнего, рецепторного) или эндогенного (нерецепторного) сигнала, запускающего процесс апоптоза; во-вторых, характерную для многих биологических процессов каскадную активацию внутриклеточных белков, реализующих программу апоптоза (инициирующих и эффекторных каспаз), которая регулируется множеством про- и антиапоптогенных белков; в-третьих, деструктуризацию жизненно важных для функционирования клетки белковых субстратов, «запуск» ядерных эндонуклеаз, деградацию ДНК до олигонуклеосомных фрагментов и формирование «апоптозных телец» с последующим их удалением путем фагоцитоза.

В базовых руководствах по иммунологическим методам выделяют следующие цитометрические методы документации апоптоза: идентификацию характерных для апоптотирующих клеток изменений мембраны; идентификацию изменений структуры и содержания ДНК. К сожалению, большинство этих методов не позволяют использовать цельную кровь, что важно при клинических исследованиях.

Развитие апоптоза уже на ранних этапах сопровождается снижением активности Mg2-зависимой аминофосфолипидтранслоказы, что приводит к нарушению фосфолипидной асимметрии мембраны и появлению фосфатидилсерина на наружном слое мембраны. Использование меченного флюорохромами (как правило, FITC) антикоагулянта аннексина V (Аn V), который специфически связывается с фосфатидилсерином в присутствии ионов Са2 и последующая цитометрия обеспечивают четкую идентификацию клеток, уходящих в апоптоз. Использование многопараметрического анализа и одновременное докрашивание клеток красителями для нуклеиновых кислот, которые не проникают в живые клетки, например йодидом пропидия (PI), позволяют дифференцировать клетки, находящиеся в ранней фазе апоптоза (An V+PI-), позднем апоптозе (An V+PI+), и мертвые клетки (An VPI+). Весьма ценной является возможность одновременной оценки экспрессии мембранных маркеров и окрашивания An V, что позволяет охарактеризовать популяцию апоптотирующих клеток.

Довольно распространенными являются методы, основанные на окрашивании клеток ДНК-флюорохромами, что связано с простотой выполнения, невысокими затратами и возможностью длительного хранения клеток. Чаще всего используют йодид пропидия и 7-аминоактиномицин D (7-AAD). В этом случае клетки фиксируют этанолом, что обеспечивает, с одной стороны, вымывание низкомолекулярных фрагментов ДНК, с другой — фиксацию клеток. Затем клетки окрашивают флюорохромом в присутствии РНКазы и в процессе цитометрии выявляют так называемый гиподиплоидный пик на гистограммах. Существенным недостатком данного подхода является довольно низкая точность идентификации апоптоза, однако он оптимален для скрининговых исследований, требующих анализа большого количества проб и характеризуется хорошей воспроизводимостью.

Тест на аллергическую реакцию. Продолжительное время работы по локализации и анализу базофилов находились вне области применения проточной цитометрии, что было связано с незначительным содержанием этих клеток в периферической крови (до 0,5%). Однако существует целый ряд специфических параметров, которые можно измерить на базофилах. Это прежде всего мембранный IgE и экспрессия СD6З-молекулы. Анализ мембранного IgE представляет достаточно сложную задачу вследствие значительных различий его экспрессии у отдельных индивидуумов. В связи с этим недавно описанные маркеры базофилов заняли важное положение среди используемых параметров для анализа аллергической реакции in vitro - это CD203c и CD294 (CRTH2).

Существенное место в процессе активации базофилов занимают такие антигены, как CD63 и CD203c. Они отличаются своей экспрессией и местоположением в клетке. CD63 находится внутри клеток на мембране гранул, которые содержат гистамин, лейкотриены и цитокины. После стимуляции аллергеном происходит дегрануляция клеток и CD63 оказывается на поверхности базофилов. Напротив, CD203c является мембранным антигеном. При активации базофилов аллергеном экспрессия СD6З-молекул увеличивается на 100%, тогда как экспрессия СD203с-рецепторов возрастает на 350%. Таким образом, определение CD203c- рецептора является наиболее информативным маркером для анализа активации базофилов.

CD294 может экспрессироваться на базофилах и одновременно на Тh2-клетках, поэтому, если локализовать путем гейтирования зону мононуклеаров, фенотип базофилов можно описать как CD294+CD3, тогда как активированные базофилы будут иметь фенотип CD3-CD294+CD203c+. При активировании базофилов in vitro в многопараметрическом анализе можно увидеть значительное повышение экспрессии молекулы CD203c на их мембране относительно контрольных образцов.

Для активации базофилов in vitro, как правило, используют агенты, активирующие максимальное количество базофилов, — это анти-IgE, анти-FceRI или синтетический пептид FMLP. В ходе анализа в дальнейшем используют различные аллергены. В настоящее время разработаны наборы, предназначенные для идентификации покоящихся и активированных базофилов. Они содержат все компоненты, необходимые для проведения анализа, за исключением аллергенов (исследователи, как правило, сами подбирают необходимый набор аллергенов в зависимости от аллергического анамнеза пациента).

Использование данного подхода предоставило недоступную ранее возможность определять сенсибилизацию к аллергенам, например лекарственным препаратам, выявлять не связанные со специфическим IgE-ответом аллергические состояния, диагностировать и дифференцировать псевдоаллергические реакции.

Таким образом, появление методов, позволяющих объективно оценивать функциональные параметры клеток в процессе их активации и пролиферации, выделяя среди совокупности всех лейкоцитов отдельные субпопуляции, значительно расширяет возможности лабораторного анализа в клинической практике. Эти возможности способствуют появлению надежного инструмента для диагностики заболеваний, в основе которых лежат механизмы повреждения иммунного гомеостаза организма. Формирование же нового подхода к диагностике дефектов иммунной системы влечет за собой и изменение обоснований для этиотропной и патогенетической иммунокорригирующей терапии.

Оцените статью: (9 голосов)
3.78 5 9

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Аналитические характеристики проточной цитофлюориметрии
Возможности проточной цитометрии
Ограничения проточной цитометрии
Основы проточной цитофлюориметрии
Оценка клеточного звена иммунитета


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти