MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Мультиплексный иммунный анализ

Методологическое развитие иммуноферментного анализа позволило создать системы, в которых разные виды захваченных молекул-мишеней проецируются в разных точках твердой фазы, что и привело к созданию мультиплексных технологий, позволяющих одновременно определять большое количество (около 100) параметров в одном биологическом образце. В качестве твердой фазы стали использовать не поверхность лунок полистироловых планшетов, а разнообразные дискретные шарики - микрочастицы.

Впервые флориметрическая технология на шариках была разработана еще в 1977 г. для определения различных антигенов в одном биологическом образце. В настоящее время такую оценку часто используют для определения а-фетопротеина, b2-микроглобулина, иммуноглобулинов и иммунных комплексов.

Технология мультиплексного анализа на шариках постоянно совершенствуется.


Изначально мультиплексный анализ выполняли в разных сочетаниях.
• В ряде тест-систем один шарик покрывали разными антителами, меченными флюоресцеином.
• В других тест-системах использовали шарики разного размера.
• Шарики могли состоять из различных материалов, таких как латекс, полистирол, полиакриламид, стекло, и соответственно имели разную способность к адсорбции.

В настоящее время распространенными методами мультиплексного анализа являются мультиплексные, в основе которых лежит «сэндвич»-метод — иммуноферментный анализ в разных комбинациях: FAST Quant, Search Light и xMAP. Каждый из этих методов имеет некоторые различия по ряду параметров: определению доступных анализируемых веществ, возможности использования новых аналитов, динамическому ряду оценки, чувствительности метода, стоимости оборудования, цене расходных материалов.

Поскольку результаты определения биологически активных веществ в каждом методе могут существенно различаться, считают, что проводить статистический анализ данных, полученных с помощью разных методов, нецелесообразно.


Для каждого отдельного исследования следует выбирать только одну технологию, для того чтобы полученные данные и выводы были репрезентативными и соответствовали требованиям доказательной медицины. Так, в анализе, основанном на микро-шариках, в качестве твердой фазы используют микрочастицы.

Их кодируют одинаковыми или разными (красными и оранжевыми) флюоресцентными метками. В хМAP-системе, например, используют шарики одного размера, внутри меченные в разных сочетаниях красными и близкими к инфракрасным флюорофорами: 658 и 712 нм. На шариках адсорбированы антитела разной специфичности, созданные к разным молекулам-мишеням, присутствующим в биологическом образце, причем возможны варианты: на разных типах шариков могут быть адсорбированы антитела к разным молекулам-мишеням либо к одной молекуле-мишени, при этом образуются ковалентные связи. Таким образом, при этом типе оценки сами шарики (их поверхность) представляют собой твердую фазу, на которой и происходят реакции «антиген-антитело» (в иммуноферментном анализе такие реакции осуществляются на поверхности пластика). После захвата соответствующих молекул-мишеней из биологической пробы различные окрашенные места на шариках заполняются, при этом оценка разных мишеней осуществляется одномоментно в одной биопробе. Детекция интенсивности захвата осуществляется с помощью считывающей системы, принцип действия которой основан на оценке интенсивности флюоресценции. Сигнал усиливается и измеряется на флюоцитометре, при этом каждая отдельная молекула-мишень определяется с помощью цветового кода, измеряемого с помощью вторичного флюоресцентного сигнала. В результате обеспечивается подсчет количества захваченных молекул-мишеней в каждом отдельном локусе шариков.

Метод позволяет проводить комплексный учет множества различных молекул-мишеней в одном биологическом образце. Чувствительность, специфичность и точность анализа при таком мультиплексном определении на шариках превышают соответствующие характеристики иммуноферментного анализа. В отличие от иммуноферментного анализа, мультиплексный анализ на микрочастицах позволяет одновременно учитывать до 100 параметров в одном образце, при этом не требуется проводить этапы отмывок. Согласно методике проведения мультиплексного анализа, биологический образец инкубируется вместе с меченными флюоресцеином антителами, а после образования иммунного комплекса по типу «сэндвича» проводится детекция только тех флюорофоров, которые связаны с поверхностью шариков.

Как в иммуноферментном анализе, так и в мультиплексном иммунном анализе в тест-системах используется принцип «сэндвича». Если биологические образцы содержат гетерофильные антитела (такие как у больных с аутоиммунными заболеваниями), неспецифическое связывание может приводить к ложноположительным результатам.

В условиях патологии уровни таких аналитов, как, например, цитокины при воспалении, могут быть существенно повышены в разных биологических жидкостях и существенно превышать динамические возможности тест-системы. Анализ стандартных кривых в мультиплексных данных является критичным для правильной интерпретации полученных данных. Классический иммуноферментный анализ очень удобен для измерения уровней одного какого-либо цитокина в биологических образцах. Однако измерение уровня одного цитокина для характеристики различных процессов, протекающих в организме, является абсолютно недостаточным, так как не позволяет получить более или менее объективную информацию о комплексных биологических взаимодействиях на клеточном уровне как в норме, так и при патологии. В последнее время возрастает интерес к интегральному изучению биологических процессов. Вследствие этого все более широкое распространение приобретают методы мультиплексного анализа. Роль повышения или понижения уровня одного какого-либо цитокина в межклеточных взаимодействиях необходимо рассматривать с учетом изменения уровней других цитокинов, присутствующих в этом же исследуемом биологическом образце.

Срок хранения
В большинстве так называемых home-made ИФА-тест-системах планшеты, покрытые антителами, используют в тот же день либо их хранят в течение непродолжительного времени (несколько дней) при температуре +4 °С или замораживают и хранят при температуре -20 °С (до 2-3 мес). В хМАР-технологии покрытые антителами микрочастицы остаются стабильными в течение 2 лет. При этом срок хранения тест-систем скорее ограничивается не этапом напыления антител, а интенсивностью свечения люминофоров. 

Производительность
С помощью хМАР-тест-системы можно одновременно определять до 100 раз- личных протеинов с широким спектром молекулярной массы — от 6 до 150 кДа всего лишь в 50 мкл биологической жидкости. ИФА-тест-система позволяет определить только один белок, причем объем биологической пробы варьирует от 100 до 200 мкл, а в дублях — от 200 до 400 мкл. Нетрудно рассчитать, какое количество биологического материала необходимо для определения уровней, например, 10 или 20 цитокинов.

Сопоставимость полученных данных
В иммуноферментном анализе для определения нескольких цитокинов каждый раз следует обращаться к изначальному образцу биологической жидкости. Обычно аликвоты замораживают и хранят при температуре -20 °С в течение ограниченного срока (до 3 мес). Недопустимо повторное размораживание и замораживание образцов. Сроки хранения биообразцов до момента постановки ИФА-тест-систем для определения цитокинов могут существенно различаться и, поскольку определение цитокинов с помощью этого метода проводят с временным интервалом, невозможно с уверенностью считать, что все условия проводимого анализа и соответственно полученные результаты адекватны и сопоставимы. хМАР-технология, в отличие от иммуноферментного анализа, позволяет определять целый ряд молекул одновременно, что снижает вероятность ошибок, связанных с условиями хранения биологических проб. И, наконец, все антитела, используемые в хМАР-технологии, в отличие от иммуноферментного анализа, сопоставимы друг с другом.

Стоимость исследования одного параметра
Если использовать МИА-технологии для определения многих цитокинов, стоимость одного определения в мультиплексной технологии становится в целом ниже, чем в имммуноферментном анализе.

Оцените статью: (11 голосов)
3.91 5 11

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Иммунохимические методы анализа
Лабораторные информационные системы
Методы видеоцифровой регистрации


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти