MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Гибридизационный анализ

фото Гибридизационный анализ
Исторически метод ДНК- или РНК-гибридизации был внедрен раньше, чем метод полимерной цепной реакции. В основе метода лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации — образованию двухцепочечных структур за счет взаимодействия комплементарных последовательностей нуклеотидов. В 1970-е гг. для выявления инфекционного возбудителя или мутации использовали ДНК-зондовую детекцию, основанную на гибридизации специфических олигонуклеотидных зондов, меченных радиоактивным изотопом (или флюорохромом) с образцом выделенной ДНК. Олигонуклеотидные зонды были синтезированы таким образом, что содержали последовательности нуклеотидов, коплементарные участку цепи ДНК-мишени с известной структурой.

Различают два типа гибридизационного анализа:
• методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе (гомологичные);
• методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носителе (гетерогенные).

Последние получили более широкое распространение в связи с тем, что имеют большие аналитическую чувствительность и специфичность, являются более технологичными, их проще стандартизировать и автоматизировать. Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности.


В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерную нейлоновую мембрану.

Протокол анализа состоит из следующих стадий:
• пробоподготовки (выделения ДНК из образца);
• фиксаций ДНК-образца на мембране;
• гибридизации с ДНК-зондом, меченным флюорофором или ферментом;
• детекции результата.

Для освобождения нуклеиновых кислот из состава клеточных структур при пробоподготовке проводят лизис клеток, а в некоторых случаях очищают препарат ДНК с помощью фенола.

Фиксацию ДНК-образца на твердом субстрате осуществляют в два этапа: вначале ДНК денатурируют с помощью щелочи, затем образец нуклеиновой кислоты фик¬сируют на носителе — нитроцеллюлозной или нейлоновой мембране, обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80 °С в вакууме. Для того чтобы олигонуклеотидный зонд не взаимодействовал с мембраной, свободные точки связывания на мембране инактивируются. На стадии гибридизации искомые фрагменты ДНК (РНК) комплементарно связываются со специфическим зондом, меченным флюорофором, радиоактивной меткой или ферментом. Избыток зонда удаляется в процессе промывки. Далее осуществляют детекцию одним из возможных методов (авторадиографическим, ферментативно-гибридизационным или флюориметрическим).




Критическим этапом в данном протоколе является неспецифическая фиксация ДНК-мишени на мембране с последующей нейтрализацией свободных точек связывания. Эффективность этой стадии в большой степени зависит от длины и структуры нуклеотидной последовательности мишени, поэтому в настоящее время, преимущественно в научных исследованиях, используют разновидности данного протокола (саузерн-блот, нозерн-блот).

В лабораторно-клинической практике метод прямого связывания мишени с твердой фазой уступил место так называемой «сэндвич»-технологии. Протокол, основанный на принципе «сэндвича», отличается от описанного тем, что участвуют два зонда, гомологичных различным участкам нуклеотидной цепи ДНК- или РНК-мишени. Один зонд фиксируют на мембране для того, чтобы связать искомую мишень, присутствующую в исследуемом образце. После гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий второй зонд, который представляет собой конъюгат олигонуклеотида и какой-либо метки. Процесс гибридизации проводят повторно, при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым участком ДНК (РНК). Дальнейший процесс детекции проводят стандартным методом в зависимости от природы метки (ферментно-гибридизационным, радиографическим, авторадиографическим, флюоресцентным, хемилюминесцентным).

В настоящее время ведутся интенсивные разработки по совершенствованию методов гибридизации в следующих направлениях:
• упрощение процедуры генного зондирования до одной-двух стадий процесса;
• отказ от сорбции мишени на мембране;
• повышение чувствительности гибридизационных методов за счет использования процедуры амплификации сигнала с зонда.

Преимущество этого подхода заключается в том, что практически сведены к минимуму подготовка клинического материала и очистка нуклеиновых кислот.


Описанная схема реализована в нескольких коммерческих тест-системах. В современных наборах реагентов применяется хемилюминесценция в качестве процесса, обеспечивающего чувствительную детекцию результатов гибридизации. Технология автоматизирована, время выполнения анализа составляет 2,5-3 ч.

По мере миниатюризации соответствующих носителей-подложек для гибридизации в практику вошли микрочипы (microarrays) с сотнями и тысячами ДНК-зондов для выявления практически любых известных генов, их вариантов и мутаций. Часто для гибридизации применяют не исходные нуклеиновые кислоты, а продукты амплификации целевых генов. Учет результатов гибридизации на биочипах осуществляется посредством оптических устройств, обычно предлагаемых фирмой-разработчиком.



Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти