MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Метод полимеразной цепной реакции

фото Метод полимеразной цепной реакции
Полимеразная цепная реакция - молекулярно-биологический метод исследования, получивший широкое распространение в современных лабораториях и используемый для диагностики инфекционных, наследственных и онкологических заболеваний, а также для исследования состава условно патогенной флоры.

Метод полимерной цепной реакции основан на принципе естественной репликации ДНК, включающем денатурацию двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и комплементарное удвоение обеих. Ценность метода заключается в многократном копировании (амплификации) определенных, специфических только для данной мишени участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение концентрации специфических для данной мишени фрагментов ДНК в миллионы раз, что значительно упрощает дальнейший анализ.


Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда основных компонентов.

Праймеры — искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Tag-полимераза - термостабильный фермент [максимальная активность фермента проявляется при температуре 70-74 °С (хотя фермент может работать и при более низких температурах)] массой приблизительно 94 кДа. Источник происхождения этого фермента — микроорганизм Thermus aquaticus, время полу- жизни которого при 94 °С составляет около 45 мин.




Тag-полимераза обеспечивает достраивание З’-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности, осуществляя синтез ДНК в направлении 5’->3’ в присутствии ионов Mg2+ и при соответствующем значении pH, а также обладает 5’->3’-экзонуклеазной активно¬стью. Наличие 5’->3’-экзонуклеазной активности делает фермент пригодным для использования его в полимерной цепной реакции в реальном времени.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов: дезоксиаденозинтрифосфата, дезоксигуанозинтрифосфата, дезоксицитозинтрифосфата и дезокситимидинтрифосфата — «строительный материал», используемый Tag-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.

Буфер — смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение pH.

Анализируемый образец — подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.

Для удобства детекции или контроля эффективности амплификации в состав реакционной смеси могут быть включены следующие дополнительные компоненты.
• Внутренние контроли — гетерологичный специфическому фрагмент ДНК, как правило, большего размера, ограниченный специфическими праймерами. Фактически представляет собой альтернативную матрицу полимерной цепной реакции и позволяет контролировать эффективность амплификации в каждой конкретной пробирке.
• ДНК-зонды — искусственно синтезированные олигонуклеотиды небольшого размера (приблизительно 30 нуклеотидов), комплементарные специфическим ампликонам. Благодаря прикрепленным к ним изотопным или флюоресцентным меткам ДНК-зонды могут быть маркерами ПЦР-продуктов.

Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси.
• Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95 °С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
• Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК- мишени. Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фраг¬мент и комплементарны противоположным цепям ДНК. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина - цитозин. Если это условие не соблюдено, отжига праймеров не происходит. После отжига праймеров Tag-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с З’-конца праймера.
• Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.

Таким образом, в идеальных условиях проведения реакции за 35 циклов полимерной цепной реакции синтезируется несколько миллиардов копий ампликона определенной длины. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции фрагмента, например, с помощью флюориметрии или методом электрофореза в геле. 

ЭФФЕКТ ПЛАТО
Процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом плато. Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов полимерной цепной реакции на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1,0 пмоль (ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции). В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации на момент достижения эффекта плато влияют: утилизация субстратов; стабильность реагентов; количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы; неспецифические продукты или праймер-димеры, конкурирующие за праймеры; концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации. Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем раньше происходит выход реакции на плато. Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточным, чтобы их можно было проанализировать.

ПРОТОКОЛ ИССЛЕДОВАНИЯ
Полимерная цепная реакция в диагностической лаборатории является достаточно сложной, многоступенчатой методикой, требующей правильного выполнения всех процедур. Ниже изложены основные специфические требования к процессам взятия образцов, выделения наследственного материала, выполнения амплификации и регистрации результатов, т. е. преаналитической, аналитической и постаналитической стадии исследования.

ВЗЯТИЕ ОБРАЗЦОВ
Клиническим материалом для исследования методом полимерной цепной реакции могут служить соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма, сыворотка, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты. Однако в большинстве анализов в качестве образца используют соскоб эпителиальных клеток и сыворотку крови пациента. К особенностям метода следует отнести то, что материал, необходимый для исследования, должен потенциально содержать искомую ДНК (например, в абсолютном большинстве случаев невозможно детектировать в крови микроорганизм Chlamydia trachomatis, так как это внутриклеточный паразит эпителиальных клеток урогенитального тракта).

ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
В зависимости от поставленных задач используют различные методики для выделения нуклеиновых кислот из биологического материала. Суть методик заключается в экстракции из исследуемого образца нуклеиновых кислот и нейтрализации ингибиторов полимерной цепной реакции. В настоящее время существуют экспресс-методики выделения ДНК, позволяющие за сравнительно небольшое время обрабатывать много образцов с минимальными трудозатратами. Если перед лабораторией стоит задача получить более чистый препарат ДНК или детектировать низкокопийный образец, существуют методики, позволяющие провести очистку с высокой чистотой, но требующие больших трудозатрат.

АМПЛИФИКАЦИЯ (УМНОЖЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ ДНК)
На данной стадии происходит накопление коротких специфических фрагментов ДНК в количестве, необходимом для их дальнейшей детекции. 

ДЕТЕКЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ
Регистрировать результат полимерной цепной реакции можно либо по завершении реакции («по конечной точке»), либо на протяжении всей реакции (в реальном времени). Классическая полимерная цепная реакция предполагает анализ результатов реакции по «конечной точке». Для этого используют методы электрофореза в геле, гибридизационно-ферментный анализ, флюоресцентную детекцию после полимерной цепной реакции и др. Различные методы детекции результатов полимерной цепной реакции имеют свои преимущества и недостатки, и, как правило, их выбирают в зависимости от задач, решаемых лабораторией. Для выявления количества ДНК в исходной пробе и наблюдения за кинетикой процесса в современных лабораториях используют метод полимерной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени.

ПОЛИМЕРНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ ПО ОКОНЧАНИИ РЕАКЦИИ
В процессе полимерной цепной реакции (при наличии в биопробе искомой ДНК) в геометрической прогрессии происходит увеличение копий ее специфического фрагмента. По окончании реакции (30-50 циклов) количество таких копий достигает значений, при которых становится возможной надежная регистрация результатов реакции.

Регистрацию результатов полимерной цепной реакции «по конечной точке» проводят несколькими способами:
• методом электрофореза в агарозном геле;
• гибридизацией фрагментов ДНК с меченым зондом, в планшете, на мембране или микропластинке (биочипы);
• флюоресцентными методами детекции (при использовании технологии разрушающихся ДНК-зондов).

В последние годы полимерной цепной реакции широко используется в лабораторной практике для идентификации таких инфекций, как трихомониаз, гонорея, ВИЧ и т. д. Преимуществом метода является то, что он универсален для диагностики любых микроорганизмов и поэтому лишен недостатков культивационных методов, связанных с высокими требованиями ряда микроорганизмов к условиям культивирования. К достоинствам также следует отнести возможность тестирования большого количества любых клинических образцов. Диагностическая ценность метода полимерной цепной реакции признана во всем мире. В соответствии с данными Европейских стандартов диагностики и лечения заболеваний, передаваемых половым путем, чувствительность полимерной цепной реакции в диагностике хламидийной инфекции составляет 70-95%, специфичность — 97-99%.

ПОЛИМЕРНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ С ДЕТЕКЦИЕЙ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
Метод полимерной цепной реакции с детекцией результатов в режиме реального времени предусматривает автоматическую регистрацию увеличения флюоресцентного сигнала, пропорционального количеству синтезированных в ходе реакции специфических фрагментов ДНК (микроорганизмов, человека, животных и т. д.).

Реакция выполняется и автоматически регистрируется специализированными приборами для осуществления полимерной цепной реакции в режиме реального времени. Программное обеспечение оборудования может автоматически переводить полученные данные в удобный для чтения врача-лаборанта формат.

В зависимости от исходной концентрации специфических нуклеиновых кислот (микроорганизмов, человека и т. д.) в исследуемом образце переход из стадии инициации в экспоненциальную стадию происходит на разных циклах. Чем больше в образце искомой ДНК, тем на более раннем цикле прибор начнет регистрировать флюоресценцию; чем меньше искомой ДНК, тем на более позднем цикле начнется автоматическая регистрация флюоресценции.

Метод полимерной цепной реакции с детекцией результатов в процессе амплификации предоставляет возможность количественно оценивать ДНК микроорганизмов в исходном материале, а также использовать мультиплексный анализ (анализ результатов по нескольким каналам детекции), что дает возможность выявлять большее количество микроорганизмов в каждой пробирке.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛИМЕРНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Теоретическая чувствительность метода полимерной цепной реакции — 1 копия искомого гена в исследуемом образце (5-10 мкл раствора ДНК). Такой результат в идеале можно получить при минимальных потерях ДНК в процессе выделения, отсутствии факторов, разрушающих ДНК, и оптимальном режиме амплификации. Однако на практике максимальная чувствительность метода полимерной цепной реакции составляет от 5 до 50 генокопий в образце, что является пороговым значением для обычной (качественной) реакции с электрофоретическим учетом результатов. На чувствительность метода могут влиять следующие факторы.
• Качество выделенной ДНК (РНК).
• Примеси и добавки (фенол, муцины и др.).
• Параметры реакции.
- Состав реакционного буфера.
- Температура и время денатурации.
- Температура отжига.
- Правильный состав и длина праймеров.
- Количество циклов полимерной цепной реакции.
• Варианты постановки полимерной цепной реакции («гнездовая», мультиплексная и др.).

Несмотря на то что методики real-time PCR в целом являются намного более чувствительными, нежели обычные (электрофоретические) способы детекции (в силу суммирования сигналов на протяжении всей реакции), на их чувствительность влияют те же факторы, связанные с подготовкой проб, сохранностью ДНК и принятым режимом полимерной цепной реакции. Считается, что минимальное количество генокопий, выявляемое при real-time PCR, составляет от 2 до 10 в исследуемом образце в зависимости от оптимальности реакционной смеси и режима полимерной цепной реакции. В такой ситуации основной проблемой становится возникновение сигнала в отрицательных контрольных пробах, который может быть сравним с минимальными значениями сигнала в испытуемых образцах.

Специфичность диагностического ПЦР-набора — способность выявлять ДНК исключительно искомого микроорганизма (микроорганизмов). При разработке специфической тест-системы на какой-либо микроорганизм выбирают специфический участок генома данного вида, имеющий как можно более существенные отличия среди всех близкородственных видов. Другой задачей при создании ПЦР-тест-системы является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев.
• Праймеры должны быть специфичными. Особое внимание уделяют 3’-концам праймеров, так как именно с них Год-полимераза начинает достраивать компле-ментарную цепь ДНК. Если их специфичность недостаточна, вероятен синтез неспецифической ДНК (дополнительные полосы, сплошной мазок на электрофорезе — «шмер»). Оценка результатов реакции становится затруднительной, легко перепутать специфический продукт амплификации с синтезированной посторонней ДНК. Часть праймеров и дНТФ расходуются на синтез неспецифической ДНК, что приводит к значительной потере чувствительности.
• Праймеры не должны образовывать димеры и петли, т. е. не должно образовываться устойчивых двойных цепей в результате отжига праймеров самих на себя или друг с другом.
• Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций (вставок) в пределах видовой или иной специфичности, взятой в качестве критерия при выборе праймеров. При попадании на такую зону отжига праймеров происходить не будет, и, как следствие, - ложноотрицательный результат.



Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти