MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Приборное оснащение в клинической диагностике

фото Приборное оснащение в клинической диагностике
ТИПЫ АМПЛИФИКАТОРОВ
Для проведения полимерной цепной реакции используют амплификаторы, или термоциклеры. В основе устройства прибора для проведения полимерной цепной реакции лежит принцип циклического нагревания-охлаждения. Эти термальные процессы обычно проходят в диапазоне температур от 95 °С (верхняя граница) до 4 °С (температура хранения проб после завершения полимерной цепной реакции). В настоящее время используют приборы для амплификации, которые имеют матрицу с лунками для стандартных ПЦР-пробирок (на 200 или 600 мкл) и электрический термоэлемент типа Пельтье для последовательного нагревания-охлаждения этой матрицы. Приборы для полимерной цепной реакции разных моделей различаются главным образом емкостью (количеством загружаемых проб), конструктивными материалами (сталь, алюминий, пластик и др.), элементами дизайна и интерфейса.

С помощью термоциклеров можно осуществлять размножение нужных участков молекул ДНК (или кДНК, полученных из РНК) в тысячах копий. Амплификаторы ДНК можно отнести к специализированным термостатам с температурой, изменяющейся во времени согласно заданной программе.

В зависимости от количества ПЦР-программ, проводимых одновременно, амплификаторы можно разделить:
• на моноблочные модели (одна программа в одном термоблоке);
• модели с двумя и более автономно функционирующих блоков;
• модели с возможностью градиента температуры в пределах одного блока («Т-градиент»).

В зависимости от задач и методов учета амплификации современные термоциклеры можно классифицировать:
• на приборы для качественной полимерной цепной реакции (только термоинкубация без системы учета результатов);
• приборы для полимерной цепной реакции и учета количества ПЦР-продукта в конечной точке реакции;
• приборы для оценки динамики и учета результатов полимерной цепной реакции в реальном режиме времени (real-time полимерной цепной реакции).

Для многих моделей амплификаторов предусмотрена возможность программирования и управления посредством компьютера.

СИСТЕМЫ ДЕТЕКЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПОЛИМЕРНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ
Классический метод детекции результатов полимерной цепной реакции — разделение ее продуктов (ампликонов) методом электрофореза в полиакриламидном геле.


Этот способ незаменим при детекции продуктов полимерной цепной реакции с малыми различиями по молекулярной массе. Однако приготовление полиакриламида достаточно трудоемко, что ограничивает его использование при массовых исследованиях. В настоящее время сепарацию продуктов амплификации чаще всего проводят в 1,5-2% агарозном геле. Учет результатов проводят в гелях, содержащих бромистый этидий, образующий химические комплексы с ДНК, которые интенсивно флюоресцируют при подсветке ультрафиолетовым излучением. Для учета результатов реакции применяют трансиллюминатор. В настоящее время используют системы видеодокументации изображений, которые включают трансиллюминатор, видеокамеру с высоким разрешением, персональный компьютер с соответствующим программным продуктом для записи и хранения изображений.

Практическими недостатками такого способа детекции являются:
• высокий риск контаминации продуктами амплификации;
• получение только качественных результатов реакции амплификации (количественный учет невозможен).

Бесфорезный качественный анализ полимерной цепной реакции
В настоящее время разработаны приборы, созданные на базе флюориметров, в которые вместо обычных кювет загружаются пробирки после проведенной полимерной цепной реакции (в которой используются специфические флюоресцентные ДНК-зонды).


С помощью таких приборов можно определять сигнал полимерной цепной реакции по наличию специфического свечения, сила которого пропорциональна количеству ПЦР-продукта. Метод хорош тем, что пробирки после полимерной цепной реакции не надо открывать и анализ целого блока пробирок (12 шт.) проводится в течение минут. При этом снижается вероятность загрязнения помещений лаборатории продуктами амплификации, как это происходит при использовании электрофореза.

ПРИБОРЫ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО УЧЕТА ПОЛИМЕРНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
• Приборы для оценки полимерной цепной реакции в режиме реального времени представляют собой своеобразный гибрид амплификатора и флюориметра и позволяют оценивать динамику полимерной цепной реакции прямо в закрытых пробирках по мере накопления продукта амплификации и проводить количественный ПЦР-анализ. Специфичность сигнала при полимерной цепной реакции в реальном времени обусловлена применением специальных ДНК-зондов с флюоресцентной меткой. В процессе полимерной цепной реакции по мере синтеза новых и новых копий искомого участка гена происходят специфическое связывание этой меченой цепочки нуклеотидов и ее разрушение с выходом красителя в окружающую среду.


По мере протекания полимерной цепной реакции светочувствительные элементы снимают показатели с каждой из пробирок и вводят эти данные в память компьютера. При этом строится динамическая кривая накопления ПЦР-продукта по отдельным пробам.

Объемы анализируемых проб, время анализа и температура измерений соответствуют таковым для обычной полимерной цепной реакции. Тем не менее в этом режиме не требуется дополнительное время на процедуры, связанные с электрофорезом, так как кривые накопления продуктов реакции доступны сразу по окончании real-time PCR. Калибровка зависит от типа имеющегося прибора. Она требуется для оптимизации параметров оптического блока и выравнивания показателей по отдельным лункам, осуществляется с теми флюорохромами, которыми помечены применяемые ДНК-зонды.

Количественная оценка ДНК или РНК патогенного микроорганизма в клинических образцах бывает исключительно важна для прогноза заболевания и контроля терапии. Эта технология активно внедряется в российские клинико-диагностические лаборатории. Кроме возможности количественного учета результатов реакции, к несомненным достоинствам real-time PCR следует отнести высокую технологичность исследования и снижение вероятности загрязнения помещений лаборатории продуктами амплификации.

ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК
Автоматическое секвенирование в большинстве приборов для клинических исследований сводится к использованию метода терминирующих NTP. На первом этапе проводятся терминирующие полимеразные реакции, затем — разделение продуктов реакций методом капиллярного микроэлектрофореза. Современное приборное обеспечение позволяет автоматизировать процесс разделения флюоресцентно-меченых фрагментов ДНК в полиакриламидном геле, получение типа и распределения эмиссии флюорофоров, последующий анализ собранных данных и выдачу готового результата.

Помимо оптимизации полимеразной реакции, важнейшим моментом является мечение определенных нуклеотидов для реакции. Это делают, включая метку в состав праймера или в нуклеотид, который терминирует реакцию. Например, каждый из четырех терминирующих нитрилотриметилфосфоновую кислоту метят «своим» флюорофором, что позволяет проводить все четыре реакции в одной пробирке и анализировать продукты реакции в пределах одной зоны электрофореза. В автоматическом секвенировании используют флюорофоры, абсорбция и излучение у которых происходят в диапазоне длин волн 450-650 нм (видимая область спектра) или 650-825 нм (ближняя инфракрасная область спектра). Оптические системы и аппаратура для обработки данных должны минимизировать возможное наложение спектров лучевой эмиссии для отдельных флюорофоров. При анализе данных следует учитывать, что некоторые флюорофорные молекулы могут изменять заряд (и соответственно подвижность) продуктов реакции в электрофорезе, что может быть причиной артефактов.

Ферменты, применяемые для секвенирующих процедур, относятся к рекомбинантным ДНК-полимеразам, не обладающим экзонуклеазной активностью и толерантностью к включению меченых дезоксинуклеотидов. Выбор термочувствительных или термостабильных полимераз определяется режимами реакции (обычной или циклической, т. е. типа полимерной цепной реакции) в зависимости от задач секвенирования в конкретном случае.

Аппаратура для секвенирующего гель-электрофореза должна обладать достаточно высоким разрешением, чтобы разделять фрагменты, различающиеся по длине лишь на один нуклеотид. Разделяют фрагменты в денатурирующем режиме. Обычно электрофорез проводится в трисборатном буфере. Важным условием при проведении электрофореза является однородность температуры геля и заключающих стекол. Прекрасным решением для автоматического секвенирования является капиллярный электрофорез в стеклянной трубке длиной 30-100 см при небольшом диаметре капилляра (50-100 мкм), что значительно ускоряет процедуру разделения.

Основные модели автоматических секвенаторов
Современные секвенаторы можно разделить по типу проводимого электрофореза на капиллярные и с гелевыми пластинами. Последние могут различаться по количеству детектируемых красителей - один, два или четыре. Капиллярные секвенаторы выпускаются только в варианте, использующем детекцию четырех флюоресцентных красок, возбуждаемых излучением аргонового лазера. Разделение фрагментов проводится в геле толщиной 0,4 мм. Возбуждение флюорофора и следующая за этим эмиссия флюоресценции происходят при прохождении меченым фрагментом ДНК зоны сканирования. Для уменьшения эффекта перекрывания спектров эмиссии получаемый сигнал пропускается через колесо с 4 последовательно заменяемыми фильтрами. В результате первичные данные представляют собой наборы из четырех чисел (в соответствии с сигналом, прошедшим через каждый из фильтров) для каждой точки сканирования (по ширине геля), собранные через равные интервалы времени в течение всего электрофореза.

Секвенаторы на гелевых пластинках обнаруживают флюоресценцию от одного до нескольких красителей. Имеется несколько модификаций в зависимости от типа лазера, направления луча возбуждающего света. В частности, у секвенатора MicroGene разделение происходит в одноразовых MicroCel-кассетах, заполняемых фотополимеризуемым акриламидом. Высота кассет варьирует от 140 до 280 мм, что позволяет секвенировать от 300 (MicroCel 300 Cassette) до 700 (MicroCel 700 Cassette) нуклеотидов. В качестве источника излучения используют гелиево-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм. Луч лазера направляют поперек геля. Это позволило отказаться от любых движущихся частей и, следовательно, значительно повысить надежность прибора и уменьшить его размеры.

Высоким качеством отличаются секвенаторы, работающие на красителях инфракрасной области спектра. Как известно, естественное инфракрасное излучение несвойственно биологическим макромолекулам и компонентам акрила- мидных гелей, поэтому регистрируется исключительно сигнал от красителя. Двухканальная система позволяет избежать перекрывания спектров эмиссии (они разнесены) и проводить одновременное двунаправленное секвенирование (сразу с двух праймеров; каждый из которых мечен своим красителем). За один прогон секвенатор IR2 DNA Sequencer способен определять более 1000 нуклеотидов.

Оцените статью: (10 голосов)
4.1 5 10

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Гибридизационный анализ
Клиническое применение результатов исследования
Метод полимеразной цепной реакции
Методы молекулярной диагностики
Методы молекулярной клинической диагностики при установлении или уточнении диагноза заболевания


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти