MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Методы молекулярной клинической диагностики при установлении или уточнении диагноза заболевания

фото Методы молекулярной клинической диагностики при установлении или уточнении диагноза заболевания
Уточняющая диагностика требует не только достаточной чувствительности, но и высокой степени специфичности определений. Задачей цитологического анализа в этих ситуациях является не только подтверждение диагноза, но и при возможности определение специфического генотипа в целях прогнозирования течения заболевания и планирования оптимальных схем лечения.

КОНТРОЛЬ В ХОДЕ И ПОСЛЕ ЛЕЧЕНИЯ
Ценность молекулярно-биологических методов наиболее высока при проведении специфической терапии из-за их высокой чувствительности и возможности отслеживать минимальные уровни патологических генных мишеней, будь то гены инфекционных патогенных микроорганизмов или онкогены при злокачественных заболеваниях. Разработка методов полуколичественной и количественной оценки количества генокопий в образце (полимерная цепная реакция в реальном времени) дает уникальную возможность отслеживать динамику концентраций патологических генов (вирусов, микробов при лечении инфекций или онкогенов при терапии лейкозов) в биологических пробах.


Особое значение имеет количественная ПЦР-диагностика при гепатитах и ВИЧ-инфекции, так как сроки назначения и интенсивность специфического лечения в этих случаях во многом зависят не только от клинического статуса, но и от содержания вируса в периферической крови, а также от генотипа вируса. Ответ на терапию определяется наряду с улучшением клинической картины по снижению содержания количества копий вируса в плазме крови. 

Другая важная область применения генной диагностики в динамике заболеваний — определение остаточных специфических онкогенов при интенсивном лечении лейкозов и лимфом. Особую роль имеет количественная диагностика минимальной остаточной болезни после трансплантации костного мозга больным с лейкозами, когда критерием излечения считается молекулярная ремиссия (содержание клеток с патогенным онкогеном менее 1 на 1 000 000 лейкоцитов костного мозга или периферической крови).


Такой же важной частью динамического наблюдения является регулярное качественное или количественное определение целевых патологических генов для оценки качества, продолжительности достигнутой клинической ремиссии и раннего выявления рецидивов болезни.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ
Учитывая многообразие генетических маркеров, определяемых методами молекулярной диагностики, и большое количество тест-систем, доступных на рынке лабораторных реагентов, правильность получаемых результатов зависит от стандартности выполнения основных этапов диагностики, а именно от заготовки и хранения биологических образцов, процесса подготовки проб, выделения нуклеиновых кислот, составления ПЦР-смесей, режима амплификации ДНК и учета результатов.

В связи с этим следует обращать внимание на следующие факторы:
• наличие регистрационного удостоверения, относящего оборудование к изделиям медицинского назначения (особенно микродозаторов, термоблоков, приборов для амплификации, средств учета и документирования результатов);
• правильное получение, хранение и доставку материала (выдача ясных и подробных инструкций врачам и медсестрам);
• стандартное выполнение процедур подготовки проб, полимерная цепная реакция, гибридизации и секвенирования ДНК персоналом лаборатории. Под этим подразумевается как работа строго по протоколам, изложенным в инструкциях от производителя, так и соблюдение общих правил работы в молекулярно-биологических лабораториях и санитарно-эпидемиологических норм при взаимном контроле и преемственности отдельных этапов исследования;
• наличие сертификатов по клинической лабораторной диагностике и молекулярно-биологическим методам исследования у врачей и среднего лабораторного персонала клинико-диагностическая лаборатории и соответствующей квалификации у биологов-исследователей;
• обязательное привлечение данных клинической картины и лабораторно-инструментальных методов исследования при комплексном обследовании больного и оценке результатов молекулярно-биологического исследования. Врачу клинико-диагностическая лаборатории важно понимать суть и значение имеющихся симптомов заболевания, чтобы провести своевременно повторное исследование или анализ дополнительных молекулярно-генетических маркеров. Специалистам по генной диагностике необходимы рабочие контакты со специалистами по иммунодиагностике, клинической биохимии, вопросам дополнительной диагностики обследованных больных.

ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ
Генную диагностику в большинстве лабораторий проводят с помощью коммерческих тест-систем для полимерной цепной реакции и/или гибридизации ДНК. Во многих из этих систем предусмотрен так называемый ген внутреннего контроля, т. е. данный ген должен выявляться в любом клиническом биологическом образце, содержащем нуклеиновые кислоты. Присутствие четкого сигнала внутреннего контроля свидетельствует о том, что подготовка проб и выделение нуклеиновых кислот из данного клинического образца проведены успешно. К каждому диагностическому набору прилагается образец положительного контроля с образцом целевого гена (в форме ДНК, кДНК, плазмиды или специфического, ампликона), а также отрицательный контроль (им может служить буферный раствор, применяемый для растворения ДНК). Эти контрольные образцы подвергают той же обработке и амплификации, что и исследуемые клинические пробы ДНК. Правильность проводимого исследования подтверждается специфическим сигналом в положительном контроле и отсутствием сигнала в отрицательном. Это свидетельствует о достаточной активности компонентов тест-системы и об отсутствии существенных загрязнений реактивов, использованных на этапе подготовки проб и выделения ДНК.

Пробы ДНК и РНК, выделенные для рутинной клинической генной диагностики, должны храниться, по крайней мере, до 1-2 мес в глубоком холоде на случай необходимости повторных или дополнительных исследований. Внутрилабораторный контроль качества проводят регулярно' путем повторных анализов положительных проб и сравнения с результатами текущих серий. Такие сравнения особенно важны при переходе с реагентов одного производителя к тест-системам другой фирмы. В мероприятиях по внутрилабораторному контролю качества особое значение имеет видеоаппаратура для фиксации и хранения результатов исследований. Помимо обычного оснащения, для учета результатов полимерной цепной реакции (трансиллюминатора, видеокамеры) необходимо иметь компьютер для сохранения полученных изображений, возможности их сопоставления и контроля в разные сроки и с разными тест-системами.

МЕЖЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ
В качестве средств межлабораторного контроля в молекулярной диагностике периодически или при необходимости проводят следующие мероприятия:
• обмен образцами ДНК и сравнение результатов, полученных разными лабораториями и разными диагностическими системами;
• подтверждающую ДНК-диагностику первично-положительных результатов, проводимую в лабораториях с большим опытом работы по диагностике конкретных патогенных микроорганизмов (например, ВИЧ-1, гепатита С).

СИСТЕМЫ ВНЕШНЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА (ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ)
По мере расширения сети лабораторий, использующих методы молекулярной диагностики, возникли проблемы стандартизации соответствующих исследований. В последние годы в различных странах создаются системы внешнего контроля качества молекулярно-биологических исследований. Учитывая многообразие генов, определяемых методами полимерной цепной реакции, и большое количество диагностических продуктов, предлагаемых на рынке лабораторных тестов, задачи системы внешнего контроля качества представляются вполне рациональными и обоснованными.

Контроль качества молекулярно-биологических исследований является одним из новых направлений работы Федеральной системы внешней оценки качества РФ. Основной задачей этой контрольной системы является оценка традиционных лабораторных показателей. Так, на 2007 г. Федеральной системы внешней оценки качества включала 121 раздел с участием более чем 7000 лабораторий по России. В программах по оценке качества полимерной цепной реакции в 2007 г. участвовали более 200 лабораторий, от которых было сделано более 400 заказов на контрольные образцы. Большая часть лабораторий проявила интерес к диагностике урогенитальных инфекций, около 25% — к контролю ПЦР-диагностики гепатита С и лишь около 5% - к диагностике туберкулеза. Это свидетельствует, с одной стороны, о достаточно ограниченном круге ПЦР-диагностикумов, предлагаемых Федеральной системой внешней оценки качества, а с другой — об узкой специализации молекулярно-диагностических исследований.в большинстве клинических лабораторий. 

Аналогичные системы контроля качества генной диагностики созданы в ряде европейских стран (Великобритании, Финляндии, Франции), они пока ограничиваются небольшим ассортиментом контрольных образцов. Так, система labquality в основном занимается оценкой качества диагностики Chlamydia trachomatis и Neisseria gonorrhoeae. Контроль качества количественной полимерной цепной реакции пока не приобрел распространения на уровне национальных систем, хотя соответствующие тест-системы, особенно наборы для диагностики ВИЧ-1, гепатитов В и С и контрольные образцы к ним, выпускаются рядом фирм в России и за рубежом. Проблема состоит в том, что в количественной ПЦР-диагностике пока не выработаны общепризнанные стандарты для количественного контроля, которые могли бы служить в качестве референтных. Количественные тест-системы от крупных фирм-производителей (Roche, Chiron и др.) после получения разрешений от своих надзорных органов могут использоваться для неофициальных референтных оценок результатов другими лабораториями с иными тест-системами.

Оцените статью: (8 голосов)
4.63 5 8

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Гибридизационный анализ
Клиническое применение результатов исследования
Метод полимеразной цепной реакции
Методы молекулярной диагностики
Молекулярные клинические методы исследования


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти