MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Цитохимические исследования гемопоэтических клеток

фото Цитохимические исследования гемопоэтических клеток
Цитохимические исследования позволяют изучить ферментативную активность, содержание различных веществ в клетках крови, костного мозга, лимфатических узлов и других тканей.

Современные цитохимические методы исследования, применяемые в гематологии в комплексе с морфологической оценкой клеточных элементов, используют для изучения направленности дифференцировки кроветворных клеток. Основой их идентификации служат особенности метаболизма, специфичные для каждого типа клеток. Цитохимические методы исследования обладают рядом достоинств: просты в исполнении, воспроизводимы, не требуют сложной, дорогостоящей аппаратуры, информативны. Цитохимические реакции проводят в мазках периферической крови, пунктатах костного мозга, лейкоконцентрате венозной крови, спинномозговой жидкости, аспиратах лимфатических узлов, селезенки, лейкозных инфильтратов различной локализации.


При цитохимических исследованиях следует учитывать, что качество препаратов и хорошая техника приготовления мазков имеют решающее значение.

Приготовление мазков
Мазки крови и костного мозга лучше делать непосредственно из материала, полученного без добавления антикоагулянтов. Если это невозможно, готовят мазки из стабилизированной антикоагулянтами клеточной взвеси или лейкоконцентрата, полученного путем щадящего центрифугирования. При выраженной лейкопении цитохимические исследования целесообразно проводить в препаратах, полученных из лейкоконцентрата венозной крови.

После приготовления мазки следует быстро высушить на воздухе до исчезновения влажного блеска, что позволит избежать сморщивания и смывания их со стекла во время фиксации. Приготовленные мазки периферической крови и костного мозга рекомендуют хранить не более суток, так как активность большинства внутриклеточных ферментов снижается.


Препараты фиксируют сразу после высушивания на воздухе.

Оценка результатов цитохимических реакций
В большинстве случаев достаточно определить характер цитохимической реакции (слабая, умеренная, интенсивная) с указанием процента положительно реагирующих клеток. При оценке PAS-реакции характер распределения положительного материала (диффузный, диффузно-гранулярный, гранулярный) имеет большую диагностическую ценность, чем измерение его общего количества (например, при острых лейкозах).

В ряде случаев применяют полуколичественный метод с подсчетом условных единиц или вычислением среднего цитохимического коэффициента. Принцип его заключен в оценке интенсивности окраски и количества положительных гранул при анализе 100 клеток:
0 — отсутствие окраски цитоплазмы расценивается как отрицательная реакция (0);
+ — слабодиффузное окрашивание или единичные гранулы в цитоплазме;
++ — диффузная окраска цитоплазмы, умеренное количество гранул;
+++ — интенсивное окрашивание цитоплазмы, многочисленные гранулы, заполняющие всю клетку.

После оценки интенсивности окраски считают количество условных единиц или средний цитохимический коэффициент.
Подсчет условных единиц (уе) по методике Kaplow:

уе = ЗхС + 2хВ + А.

Вычисление среднего цитохимического коэффициента:

Средний цитохимический коэффициент =(ЗхС + 2хВ + А)/ 100,

где А — количество клеток со слабоположительной реакцией; В — количество клеток с умеренно положительной реакцией; С — количество клеток с резко выраженной реакцией. При этом показатель активности реакции в условных единицах может колебаться от 0 до 300, а средний цитохимический коэффициент - от 0 до 3.

Миелопероксидаза
Миелопероксидаза преимущественно локализована в специфических азурофильных гранулах в цитоплазме гранулоцитов и служит маркером клеток миелоидного ряда. В клетках миелопероксидаза участвует в реакции разрушения токсичной перекиси водорода. В цитохимических реакциях активность фермента определяют по окислению хромогенов (бензидина, о-дианизидина и др.). Миелопероксидазу выявляют в клетках гранулоцитарного ряда, начиная с миелобласта. Активность фермента нарастает по мере созревания клеток. В сегментоядерных нейтрофилах здоровых людей выявляют высокую активность миелопероксидазы, содержащуюся в клетках в виде гранул, которые заполняют цитоплазму.

Самую высокую активность фермента наблюдают в зрелых эозинофилах. В базофильных промиелоцитах и миелоцитах активность миелопероксидазы, как правило, высокая, однако по мере дифференцировки их в зрелые клетки активность фермента снижается. Зрелые базофилы могут быть почти отрицательными по данному признаку. Слабоположительна реакция на миелопероксидазу в различном проценте моноцитов в виде немногочисленных рассеянных гранул. В эритрокариоцитах, лимфоцитах, базофилах и мегакариоцитах активность миелопероксидазы не определяется.

В крови здоровых людей 3-16% нейтрофилов окрашены резко положительно, 60-90% — положительно, остальные — слабоположительно. Средний цитохимический коэффициент нейтрофилов здоровых людей — 2,56±0,33.

Реакцию используют главным образом в целях диагностики острых лейкозов. При острых миелобластных лейкозах активность фермента в опухолевых клетках варьирует от умеренной до выраженной в зависимости от степени дифференцировки бластов. Так, при острых миелобластных лейкозах с низкой степенью дифференцировки (Mt по ФАБ-классификации) количество МПО-положительных бластов невелико (не превышает 10%), активность фермента в них невысокая. В то же время при остром промиелоцитарном лейкозе миелопероксидазу выявляют практически в 100% бластных клеток и активность ее равноценна таковой в зрелых нейтрофилах.

При острых монобластных лейкозах реакция на миелопероксидазу в опухолевых клетках слабая, при острых лимфобластных — отрицательная. Отсутствие точных количественных способов оценки цитохимических реакций не позволяет использовать их для верификации степени дифференцировки бластных клеток и, следовательно, для более тонкой дифференциальной диагностики острых лейкозов. Таким образом, та или иная цитохимическая реакция определяет линейную направленность, а не степень дифференцировки бластных клеток.

Липиды
В гемопоэтических клетках липиды рассеяны в виде тонкодисперсных образований, которые неразличимы в световом микроскопе без специальной окраски. Стабильные и хорошо воспроизводимые результаты для исследования гемопоэтических клеток получаются при применении метода с Суданом черным Б.

Липиды обнаруживают практически во всех лейкоцитах, за исключением лимфоцитов. Однако основная масса липидов связана с клетками гранулоцитарного ряда. Они входят в состав специфической зернистости нейтрофильных гранулоцитов, эозинофилов и накапливаются по мере созревания клеток. В миелобластах обычно присутствует скудное количество гранул, локализованных в перинуклеарной зоне, в промиелоцитах их становится несколько больше, в миелоцитах и метамиелоцитах содержание суданофильных гранул высокое. В зрелых нейтрофилах липиды заполняют всю цитоплазму.

На всех стадиях созревания эозинофилов обнаруживают липиды по периферии специфических гранул с неокрашенной или слабоокрашенной центральной зоной. Большинство незрелых базофилов дают положительную реакцию, по мере созревания клеток содержание липидов в них снижается. Реакция в зрелых базофилах вариабельна — от слабоположительной до отрицательной.

Нормальные величины: большинство нейтрофилов (69-80%) у здоровых людей окрашиваются интенсивно, 18-36% — среднеинтенсивно и 10% окрашены слабо.

PAS-реакция
Механизм PAS-реакции основан на окислении йодной кислотой гликолевых групп или их амино- или алкиламинопроизводных до альдегидов. Альдегидные группировки при взаимодействии с реактивом Шиффа образуют продукт красного цвета. Мукополисахариды (гликозаминогликаны) определяют во всех морфологически идентифицируемых клетках гранулоцитарного ряда. Концентрация PAS- положительного материала в клетках гранулоцитопоэза нарастает по мере созревания клеток. Диффузное окрашивание цитоплазмы обычно свойственно наиболее молодым клеткам гранулоцитарного ряда (миелобластам, промиелоцитам, миелоцитам). В зрелых нейтрофилах содержится много PAS-положительного вещества в виде мелких гранул, упакованных так плотно, что цитоплазматический фон плохо различим. В зрелых эозинофилах и базофилах PAS-положительный материал расположен следующим образом: специфические гранулы остаются неокрашенными и резко выделяются на фоне диффузного окрашивания цитоплазмы.

В моноцитах PAS-положительный материал чаще выявляют в виде мелкой пылевидной зернистости на фоне слабо-розового диффузного окрашивания.

В лимфоцитах концентрация мукополисахаридов меньше, чем в гранулоцитах. В норме 10-40% лимфоцитов периферической крови содержат PAS-положительный материал, расположенный в виде гранул вокруг ядра, в 1-2% клеток гранулы могут быть интенсивно окрашены и образуют крупные блоки. Нормальные величины: в 95-100% нейтрофилов PAS-реакция выявляется в диффузной форме, средний цистохимический коэффициент — 2,09-2,99, от 2 до 33% лимфоцитов содержат PAS- положительное вещество в гранулярной форме, средний цистохимический коэффициент — 0,02-0,52. Вместе с реакцией на миелопероксидазу и неспецифическую эстеразу PAS-реакция — один из основных цитохимических методов для дифференциальной диагностики острых лейкозов.

При диагностике острых миелобластных лейкозов бластные клетки могут быть либо PAS-отрицательными, либо обнаруживается слабодиффузное окрашивание цитоплазмы. Яркое диффузное окрашивание цитоплазмы наблюдают только при остром промиелоцитарном лейкозе.

В монобластах реакция может быть отрицательной, слабоположительной в диффузной или диффузно-гранулярной форме (когда продукт реакции выявляют в виде рассеянных мелких или средних гранул, расположенных по краю цитоплазмы, на диффузном фоне). В то же время при остром лимфобластном лейкозе бласты содержат гликоген в цитоплазме в виде средних и крупных гранул, расположенных венчиком вокруг ядра, иногда сливающихся в блоки. Количество клеток с таким характером PAS-реакции сильно варьирует при различных случаях острого лимфобластного лейкоза.

Неспецифические эстеразы
Неспецифические эстеразы — неоднородная группа лизосомальных ферментов, отличающихся по субстратной специфичности и действию активаторов и инги-биторов. На основании этого были разработаны различные методики выявления эстераз в качестве потенциальных маркеров основных популяций лимфоцитов. В гематологии наиболее часто определяют а-нафтилацетатэстеразу, хлорацетатэстеразу, кислую а-нафтилацетатэстеразу.

а-Нафтилацетатэстеразу обнаруживают во всех клетках миелоидного ряда, начиная с миелобласта. Она активна в эозинофилах вне всякой связи с их специфической зернистостью, в небольшом количестве лимфоцитов, эритрокариоцитах, мегакариоцитах и тромбоцитах. Самую интенсивную реакцию дают моноциты и макрофаги. Активность неспецифической эстеразы в клетках моноцитарного ряда легко ингибируется фторидом натрия, но не подавляется в гранулоцитах. Этот феномен позволяет отличить клетки системы мононуклеарных фагоцитов от клеток других ростков кроветворения, обладающих активностью неспецифической эстеразы. Активность нафтил-АБ-О-хлорацетатэстеразы выражена в клетках гранулоцитарного и отсутствует в клеточных элементах моноцитарного и лимфоцитарного рядов. Кислую а-нафтилацетатэстеразу рано выявляют в процессе дифференцировки Т-лимфоцитов, где она локализована в виде фокального пятна в цитоплазме.

Определение активности неспецифической эстеразы используют для идентифи-кации лейкозных моноцитарных предшественников. Эти клетки проявляют высокую активность неспецифической эстеразы с субстратами бутират, ацетат и AS-D- ацетат, эта активность в значительной степени ингибируется фторидом натрия. Реакции на нафтил-АБ-В-хлорацетатэстеразу по надежности выявления гранулоцитарной направленности дифференцировки сравнимы с пероксидазной реакцией. Реакция на а-нафтилацетатэстеразу наиболее достоверна для идентификации монобластного и моноцитарного типов лейкозов. При остром миеломонобластном лейкозе рекомендуют использовать двойное окрашивание с различными красителями на наличие хлорацетатэстеразы и а-нафтилацетатэстеразы.

Фосфатазы
Кислая и щелочная фосфатазы — ферменты, обладающие общим свойством — способностью освобождать фосфат из спиртовых и фенольных фосфомоноэфиров при соответственно кислом или щелочном pH среды. Цитохимическое выявление фосфатаз в световом микроскопе основано на образовании нерастворимого окрашенного осадка в местах, где происходит гидролиз субстрата. Наиболее распространенный метод определения активности фосфатаз — метод азосочетания, который включает использование субстратов, содержащих фосфат нафтола или производное нафтола. Различные методы отличаются деталями фиксации, выбором производных нафтола, но все они дают, по существу, одинаковые результаты с минимальными вариациями чувствительности и распределения гранулярной окраски в положительно реагирующих клетках.

Щелочная фосфатаза
Активность щелочной фосфатазы присуща только зрелым клеткам гранулоцитарного ряда, преимущественно нейтрофилам. Изредка в эозинофилах встречается фоновая окраска цитоплазмы, но не специфических гранул. Базофилы, лимфоциты, моноциты, эритроциты и тромбоциты не содержат щелочную фосфатазу как в норме, так и при патологических состояниях.

Показатели активности щелочной фосфатазы широко варьируют при различных состояниях. Определение активности щелочной фосфатазы применяют для дифференцировки хронического миелолейкоза от других миелопролиферативных заболеваний и реактивных изменений. Активность щелочной фосфатазы увеличивается при истинной полицитемии, идиопатическом миелофиброзе, бактериальных инфекциях и резко снижается при хроническом миелолейкозе.

Низкие показатели щелочной фосфатазы почти всегда обнаруживают при Ph-положительном хроническом миелолейкозе, а также при Ph-отрицательном ювенильном хроническом миелолейкозе. Лишь гемолитическая и железодефицитная анемии или некоторые вирусные заболевания показывают сравнительно низкий средний цистохимический коэффициент для щелочной фосфатазы. У больных с хроническим миелолейкозом в период ремиссии активность щелочной фосфатазы может быть в норме или даже повышенной.

Кислая фосфатаза
Кислая фосфатаза — лизосомальный фермент, обнаруживаемый в цитоплазме большинства ядросодержащих клеток крови. Наиболее высока активность кислой фосфатазы в плазматических клетках, мегакариоцитах, тромбоцитах, моноцитах и макрофагах, гранулоцитарных предшественниках. По мере созревания клеток нейтрофильного и эозинофильного ряда активность фермента снижается. Локализована кислая фосфатаза в основном в первичных гранулах и отсутствует во вторичных. Зрелые нейтрофилы и эозинофилы обладают либо низкой ферментативной активностью, либо лишены ее. В лимфоцитах активность кислой фосфатазы весьма вариабельна.

При Т-клеточном остром лимфобластном лейкозе, плазмоцитоме, волосато-клеточном лейкозе проявляется положительная окраска в плазматических клетках, Т-лимфоцитах и особенно бластных клетках. Снижение активности кислой фосфатазы в лимфоцитах отмечают при хроническом лимфобластном лейкозе и неходжкинских злокачественных лимфомах, увеличение — при инфекционном мононуклеозе. Продукт реакции выявляют в виде мелкой пылевидной зернистости либо фокального пятна в цитоплазме лимфоцитов. Определение активности кислой фосфатазы имеет значение в диагностике волосатоклеточного лейкоза, при котором в клетках выявляют тартратрезистентную кислую фосфатазу.

Окраска на сидеробласты
Сидеробласты и сидероциты — это нормобласты (эритробласты) и эритроциты, содержащие в цитоплазме негемоглобиновое железо в виде гранул, окрашиваемых в реакции с берлинской лазурью. Если гранулы свободного железа многочисленные, грубые и располагаются вокруг ядра, образуя кольцо, такие клетки называют кольцевидными сидеробластами. Содержание сидероцитов в периферической крови не превышает 1,1% (0,60- 0,04%), в костном мозге — 0,2-2,1% (0,09-0,90%). Содержание сидеробластов в костном мозге — 23,7±2,4%.

Соединений железа обычно не обнаруживают в лейкоцитах, тогда как выявление их в эритрокариоцитах информативно для подтверждения неэффективного эритропоэза и диагностики некоторых вариантов миелодиспатического синдрома. При миелодиспатическом синдроме железо, поступающее в эритробласты, не используется для синтеза гемоглобина и откладывается в эритрокариоцитах (сидеробластах), костномозговых макрофагах в виде гемосидерина или ферритина.

Исследование сидеробластов в костном мозге дает полезную информацию для оценки адекватности накопления железа в организме. Истощение запасов железа происходит при железодефицитной анемии и сопровождается снижением количества сидеробластов. Избыточное накопление наблюдают при идиопатическом и приобретенном гемохроматозе, хронической гемолитической анемии, талассемии и миелодиспатического синдрома, что приводит к увеличению количества сидеробластов. При диагностике такого варианта миелодиспатического синдрома, как рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами, отличительным признаком является присутствие в костном мозге более 15% кольцевидных сидеробластов.

Значение цитохимических реакций в онкогематологии
Основное применение цитохимические методы находят в диагностике гемобластозов. Стандартной панели цитохимических методов (липиды, PAS- реакция, а-нафтилацетатэстераза) в большинстве случаев бывает достаточно для выявления линейной принадлежности опухолевых клеток.

Цитохимические реакции используют в целях:
• установления варианта острого лейкоза и бластного криза хронического миелобластного лейкоза;
• дифференциальной диагностики идиопатического миелофиброза (сублейкемического миелоза) и хронического миелобластного лейкоза;
• диагностики волосатоклеточного лейкоза и лимфомы селезенки с отростчатыми лимфоцитами;
• выявления особенностей метаболизма лейкозных клеток.

Цитохимическими маркерами бластов гранулоцитарного ряда служат миелодиспатический синдром, липиды и AS-D-хлорацетатэстераза. Содержание этих ферментов в миелобластах сильно варьирует. В некоторых случаях можно выявить один или два из пере-численных маркеров (чаще липиды). Именно поэтому во избежание ошибочного заключения при получении сомнительного результата необходимо проведение двух реакций. Активность AS-D-хлорацетатэстеразы существенно ниже, чем активность миелодиспатического синдрома. поэтому определение этого фермента представляет меньшую диагностическую ценность. Активность миелодиспатического синдрома у детей до 15 лет и пациентов старше 60 лет ниже, чем у людей среднего возраста. Для определения монобластов важно измерение неспецифической эстеразы, подавляемой фторидом натрия. Для лимфобластов характерны отрицательная реакция на миелодиспатический синдром и положительная PAS-реакция в гранулярной форме.



Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти