MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Цитогенетический анализ

фото Цитогенетический анализ
Материалом для исследования обычно служат метафазные или прометафазные клетки, накопленные in vitro. Цитогенетики, изучая кариотипы этих клеток, стремятся определить связь их изменений с фенотипическими проявлениями заболевания и установить вклад перестроек хромосом в обоснование диагноза заболевания и прогноза его течения. При любом кариотипировании клеток необходимо провести изучение достаточного количества контрольных проб и тест-наборов как нормальных, так и с анеуплоидией, структурными перестройками, хрупкими областями, сестринскими хроматидными обменами и т. д. При изучении хромосомных аберраций необходимо правильно отбирать клетки для исследования.

Пригодными считают метафазные пластинки, удовлетворяющие следующим требованиям:
• все хромосомы должны быть хорошо прокрашены и равномерно разбросаны;
• в поле зрения не должно быть случайных хромосом;
• уровень конденсации хромосом должен находиться в следующих пределах: максимум — малые акроцентрики видны в виде четких структур, а не в виде точек (чтобы ошибочно их не принять за точечные фрагменты); минимум — хромосомы разделены на две хроматиды и лежат отдельно друг от друга;
• не допускается наличия в метафазной пластинке хромосом, вошедших в анафазу, так как их трудно отличить от парных фрагментов;
• не допускается анализа метафазных пластинок с большим количеством наложений хромосом;
• обычные потери хромосом из-за методических манипуляций регламентируют проведение анализа только на клетках с числом хромосом от 44 до 47;
• при выяснении количественных параметров действия мутагенного фактора основным критерием является количество поврежденных хромосом; этот критерий принято выражать по отношению к количеству неповрежденных хромосом.

Препараты метафазных хромосом
Субстрат исследования — способные к митозу пролиферирующие клетки костного мозга, лимфатических узлов, селезенки, ткани опухоли или ворсинчатого хориона в прямых препаратах.


В гематологии прямой метод кариотипирования клеток костного мозга является методом выбора. В целях установления конституциональных изменений генома исследуют наборы хромосом клеток периферической крови (лимфоцитов), культивируемых in vitro в питательной среде с митогенами (фитогемагглютинином, конканавалином А, ионофором кальция А 23187 и др.). В культурах исследуют и фибробласты кожи, клетки амниотической жидкости, костного мозга или лимфоидной ткани.

Методы молекулярно-цитогенетического исследования
Стандартное цитогенетическое исследование дифференциально окрашенных метафазных хромосом имеет ряд объективных ограничений: неоднородность клеточной популяции в отношении митотической активности, индекса спирализации и плохого расхождения хромосом; недоступность для анализа клеток, находящихся в интерфазе. В процессе предварительного культивирования возможен избирательный выход в митоз клеточных клонов, имеющих селективные преимущества роста, что также искажает получаемые результаты. Кроме того, репрезентативность классической цитогенетики из-за трудоемкости ее методов невысока: обычно исследуют не более 15-20 метафазных пластинок. Для современного этапа в развитии цитогенетики характерна активная разработка интерфазной методологии, что существенно дополняет методы классического хромосомного анализа.

Цитогенетики все шире используют молекулярные методы кариотипирования, к которым относят:
• гибридизацию in situ с использованием специфических проб к центромерам:
• метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) с помощью специфических ДНК-зондов;
• метод мягкой гипотонической обработки, оставляющей сохранными клеточную мембрану и цитоплазму клетки, и фиксацию кислотой или формальдегидом перед иммунохимией (МАС-морфология, антитела, хромосомы);
• FICTION (Fluorescence Immunophenotyping and interphase Cytogenetics as a Toolfor Investigation Of Neoplasm's);
• метод многоцветного спектрального кариотипирования (SKY).

Метод MAC может комбинироваться с гибридизацией in situ (MACISH), и тогда интерфазные клетки становятся легкообрабатываемым материалом, особенно при заболеваниях, где получить метафазные пластинки трудно.


FISH-метод позволяет относительно быстро исследовать сотни интерфазных ядер или метафазных плаcтинок низкого морфологического качества для выявления перестроек того или иного гена. Метод FICTION нашел применение при исследовании хромосомных аберраций при лимфосаркомах. С помощью SKY-метода проводят анализ всего хромосомного набора в одном эксперименте.

В гематологии применение FISH-метода особенно перспективно при лимфопролиферативных заболеваниях с низким митотическим индексом или при Ph-негативных вариантах хронического миелолейкоза, когда этот метод становится единственно возможным для выявления химерного гена bcr\abl а также при дифференциальной диагностике с другими миелопролиферативными заболеваниями или оценке эффективности терапии. Детальная цитогенетическая характеристика для прогнозирования течения заболевания часто невозможна из-за сложности и множественности хромосомных перестроек. Тогда полезно использовать многоцветное спектральное кариотипирование (SKY) с ДНК-зондами на весь хромосомный набор клетки.

Использование молекулярных подходов в клинической практике началось в 1986 г., когда был предложен FISH-метод, разработанный для выявления специфических нуклеотидных последовательностей ДНК в клетках, фиксированных на предметных стеклах (цитогенетические, цитологические и гистологические препараты).


Принцип метода заключен в возможности гибридизации между ДНК клетки-мишени и ДНК-зондом, меченным флюорохромом и имеющим последовательность нуклеотидов, комплементарную исследуемому участку макромолекулы.

Метод включает три обязательных этапа:
• предварительную денатурациию двухцепочечной ДНК-клетки и ДНК-зонда;
• гибридизацию в условиях избыточного содержания зонда;
• выявление флюоресцентного сигнала.

Локализацию связывания определяют при флюоресцентной микроскопии. Для изучения хромосомных аномалий обычно используют три типа ДНК-зондов, количество которых в связи с бурным прогрессом в изучении молекулярных меха-низмов патогенеза опухолей будет расти.

Концепция многоцветного спектрального кариотипирования (многоцветная SKY) предложена в конце 1990-х гг. На ее основе были разработаны методы мечения хромосом комбинацией флюорохромов и регистрации флюоресценции путем оцифровки сигнала и анализа изображения. SKY-метод позволяет одновременно проанализировать все 46 хромосом, окрашенных в специфические для каждой пары аутосом цвета. На конечном этапе обработки изображения каждой хромосоме присваивается классификационный номер. Для этого параметры полученных спектров автоматически сравниваются с базой данных компьютера, где хранятся спектры каждой хромосомы. Единицы изображения с одинаковым цветом получают одинаковую окраску. Метод позволяет идентифицировать вставки, маркерные хромосомы, транслокации и субмикроскопические хромосомные перестройки.

Современное кариотипирование
Методы анализа хромосом используют в целях изучения клеточного цикла, исследования генной амплификации, определения кластерности синдромов повреждения хромосом, оценки хрупких хромосомных областей и полиморфизма хромосом при мониторинге трансплантаций органов или тканей.

С помощью ДНК-зондов и гибридизации in situ не только определяют хромосомные перестройки, но и проводят генное картирование. Получили распространение пренатальная диагностика и мониторинг беременности. В настоящее время цитогенетическую «прописку» на хромосомах человека получили около 1500 клинических состояний, среди которых менделирующие расстройства (предрасположенность к заболеваниям), болезни с конституциональными хромосомными перестройками (идентифицированными или предполагаемыми), злокачественные новообразования (солидные опухоли и гемобластозы), заболевания, ассоциированные с мутациями митохондриальной ДНК. Нет сомнения, что хромосомные аберрации маркируют аномалии полового созревания и некоторые наследуемые патологические состояния. Предприняты попытки создания регистра генных компонентов и полигенной специфики таких заболеваний, как диабет и психозы.

Цитогенетика острых и хронических лейкозов
За последние десятилетия с помощью цитогенетики была накоплена обширная информация о значительном количестве хромосомных нарушений, специфичных для ряда гемобластозов. Выявлен клоновый характер изменений кариотипа гемопоэтических клеток, лежащий в основе развития лейкозов и лимфатических опухолей. Цитогенетический анализ в гематологии стал играть важную роль в диагностике, прогнозировании течения заболеваний и оценке эффективности применяемой тера-пии. Изменения хромосом при заболеваниях системы крови сложны и затрагивают как количественный состав наборов — численные аберрации, так и структуру отдельных хромосом — структурные аберрации. При типичных для острых и хронических гемобластозов хромосомных аберрациях смена локализации или повреждение структуры генов может приводить к нарушению их экспрессии или к структурно-функциональным изменениям кодируемых ими белков. По-видимому, эти изменения играют интегральную роль в патогенезе, а возможно, и в прогрессии лейкоза.

При хроническом миелолейкозе, хроническом лимфолейкозе, хроническом миеломоноцитарном лейкозе, В-лимфосаркоме хромосомные аберрации типа t(9;22), t(5;12), t(14;19), t(14;18) приводят к перестройкам генов bcr; ahl, tel или bcl, химерные белковые продукты которых, меняя характер клеточной пролиферации (при этом не являясь трансформирующим сигналом), делают клетки бессмертными.

При острых лейкозах повреждения хромосом с локализацией 11q23 (острые лимфоидные и миелоидные лейкозы), 15q22 и 17q12 (острый промиелоцитарный лейкоз и реже бластный криз хронического миелолейкоза), а также 21q22 (острый миелобластный лейкоз, бластный криз хронического миелобластного лейкоза), как правило, видоизменяют генетические факторы транскрипции (MILL, PML, RAPA, AML) и тем самым нарушают клеточную и тканевую дифференцировку, создавая базу для злокачественной трансформации клеток.

Кроме перечисленных хромосомных аберраций, при лейкозах часто регистрируют мутации генов. Так, мутации семейства протоонкогенов RAS бывают в 4% случаев хроничсекого миелолейкоза на стадии развернутых проявлений заболевания и в 26% — острого миелобластного лейкоза (чаще при остром миеломонобластном лейкозе), сочетаясь с большей продолжительностью жизни больных.

Примерно у 20% больных острыми нелимфоцитарными лейкозами отмечены мутации протоонкогенов FMS (локализованы на хромосоме 5q33) и повышение тирозинкиназной активности. При хроническом миелобластном лейкозе частые мутации протоонкогена ТР53 (хромосома 17р13), т. е. утрата аллеля гена р53, как правило, сочетаются с бластной трансформацией хронической стадии лейкоза.

Аберрации некоторых хромосом, например —7, — Y, del(5q), del(7q) и del(llq), также приводят к значительному изменению фенотипа клеток. Однако пока мало сведений о содержании супрессоров в утрачиваемых при этом областях хромосом, в частности генов, вовлекаемых в миелоидный лейкогенез. Показано, что при делеции 5q- из маркированных ею клеток исчезают факторы дифференцировки миелобластов: гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, протоонкоген FMS, интерлейкины -3, -4 и -5, FER-ген тирозинкиназы, ген интерферонрегуляторного фактора (IRF1).

Возможно, что упомянутые здесь хромосомные перестройки играют определенную роль в генезе вторичных лейкозов. Менее изучены повреждения генома гемопоэтических клеток при остром миеломонобластном лейкозе, где инверсия inv(16)(pl3q22) приводит к образованию химерного гена CBF (PEPB2B)/MYH11, а транслокация t(6;9)(p23;q34) и генный маркер DEC/CAN ассоциируются с плохим прогнозом течения заболевания у молодых больных. Аналогично острый монобластный лейкоз с транслокацией t(9;11) (p22:q23) и химерным геном AF9/MLL протекает с высоким бластозом и плохим ответом на терапию. У некоторых больных острого миелобластного лейкоза методом FISH обнаружена делеция гена MRP (ген кодирует белок множественной лекарственной устойчивости). В лейкогенезе острого мегакариобластного лейкоза пока неясную роль играют транслокация t(16;21)(p1;q2) и ее сливной ген ERG/FUS (протоонкоген гомологичен онкогену v-ets).

Таким образом, несомненна перспективность цитогенетического метода для обнаружения причинно-следственных связей при заболеваниях человека. В ближайшее время цитогенетический метод будет все более востребован при диагностике многих заболеваний человека с хромосомными аберрациями и генами, локализованными в них.



Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти