MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Тромбоцитарный компонент гемостаза

Характеристика структуры и свойств тромбоцитов
Тромбоциты — безъядерные дисковидные клетки, образующиеся из мегакариоцитов в костном мозге. После выхода в кровь они в течение 7-10 сут циркулируют в кровотоке и частично депонируются в селезенке, а затем утилизируются ретикулоэндотелиальной системой. Размеры большинства зрелых форм составляют 2,0-3,5 мкм. Тромбоциты окружены двухслойной фосфолипидной мембраной со значительной асимметрией слоев и многочисленными инвагинациями мембраны внутрь клетки. Тромбоцит обладает способностью изменять форму и увеличивать свою площадь при активации. Большая часть содержащихся в тромбоцитах биологически активных веществ находится в плотных тельцах, а-гранулах и лизосомах. Большое значение для гемостатических реакций имеет содержимое а-гранул — фактор V, PDGF, фактор фон Виллебранда, антигепариновый фактор, фибриноген и др.


В плотных тельцах сконцентрированы вещества с небольшой молекулярной массой — серотонин, адениновые нуклеотиды, пирофосфат, Са2+ и другие, необходимые для поддержания спазма мелких сосудов при повреждении тканей. В лизосомах содержатся гидролитические энзимы — p-глюкуронидаза, р-галактозидаза, кислая фосфатаза, неспецифическая эстераза и др.

РОЛЬ ТРОМБОЦИТОВ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ
Тромбоциты участвуют в реакциях остановки кровотечения как из мелких (формируя тромбоцитарную пробку), так и из крупных (способствуя образованию тромбоцитарно-фибринового сгустка) сосудов. В ответ на контакт с агентами, отличающимися по своим физико-химическим свойствам от нормальных эндотелиальных клеток, тромбоциты изменяют свою дисковидную форму, на их поверхности появляются многочисленные отростки.


Одновременно происходят структурная перестройка внутренней части клеток и транспозиция (флип-флоп переход) мембранных фосфолипидов с отрицательным зарядом на наружную поверхность мембраны. Через канальцевую систему тромбоцитов вещества из гранул и других внутриклеточных структур выделяются в кровь (реакция высвобождения). В результате структурных изменений тромбоциты становятся способными к агрегации и формированию уникальной композиции фосфолипидов в месте повреждения, что значительно увеличивает скорость активации коагуляционных факторов и образование фибрина. После формирования и уплотнения фибринового сгустка на его поверхности тромбоциты образуют атромбогенный монослой, напоминающий по своим свойствам эндотелий.

Основные физиологические функции тромбоцитов:
• ангиотрофическая функция;
• регуляция проницаемости сосудистой стенки;
• адгезивная и агрегационная функция;
• при нарушении целостности сосудов — поддержание спазма артериол за счет выделения биологически активных субстанций;
• фиксация сгустка фибрина к месту повреждения сосуда;
• участие в активации коагуляционных факторов, формирование протромбиназного комплекса;
• участие в активации протеина С;
• ретракция тромбоцитарно-фибринового сгустка;
• формирование гемостатически нейтральной поверхности сгустка;
• репаративная функция.

Преаналитические особенности
Определение количества тромбоцитов возможно в венозной или капиллярной крови, стабилизированной цитратом натрия или ЭДТА. При исследовании образцов венозной крови следует использовать пластиковые вакуумные пробирки или микроконтейнеры с нанесенным на стенки мелкодисперсным порошком солей ЭДТА (для гематологических анализаторов). При получении цитратной крови следует точно соблюдать ее разведение цитратом 9:1; при значительном отклонении от нормы показателей гематокрита объем цитрата необходимо скорригировать. Пробирки с кровью важно тщательно перемешать переворачиванием или вращением (без встряхивания). Температура при транспортировке образцов крови должна быть комнатной, поскольку при охлаждении происходят активация и агрегация тромбоцитов. Подсчет тромбоцитов необходимо выполнить в течение 4 ч после взятия венозной крови.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
В охлажденных образцах крови и при гемолизе возможно занижение количества тромбоцитов. При наличии аутоантител к тромбоцитам соли ЭДТА нередко индуцируют их агрегацию, в результате при исследовании на гематологических анализаторах может наблюдаться псевдотромбоцитопения. Проблема решается применением забуференного раствора цитрата натрия при взятии крови и определении количества тромбоцитов микроскопическим методом.

Аналитические технологии, методики исследования
Микроскопический метод подсчета тромбоцитов
Основан на подсчете тромбоцитов в камере Горяева с использованием обычного микроскопа или прибора с фазово-контрастной приставкой после разведения крови и лизиса эритроцитов раствором оксалата аммония. Метод требует опыта, напряжения зрения, концентрации внимания. Коэффициент вариации результатов исследования у опытного лаборанта достигает 10%. 

Подсчет клеток крови в гематологическом анализаторе
Эти приборы существенно облегчают и ускоряют процедуру и повышают точность подсчета тромбоцитов. Большинство современных автоматических гематологических анализаторов позволяют определить дополнительные показатели тромбоцитарного звена: MPV, PDW, РСТ. Коэффициент вариации при подсчете тромбоцитов в гематологических анализаторах составляет менее 3-5%. На точность подсчета существенное влияние оказывают качество и надежность используемых калибраторов, а также соблюдение правил преаналитического этапа.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для оценки качества подсчета тромбоцитов на гематологических анализаторах существуют контрольные образцы с разным содержанием этих клеток; в то же время не существует общепринятых рекомендаций по использованию этих же образцов для определения микроскопическим методом. Следует периодически контролировать воспроизводимость результатов определения количества тромбоцитов разными лаборантами.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
У здорового человека в периферической крови содержание тромбоцитов, согласно нормам, принятым в России, колеблется в диапазоне 180-320х109/л. На гематологических анализаторах, поступивших из-за рубежа, установлены референтные значения в диапазоне 150-400х109/л. Различия норм могут быть связаны, в частности, с разными требованиями к подготовке пациентов к исследованию: в России требуется сдача крови натощак, в странах Западной Европы допускается сдача крови после завтрака.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Тромбоцитопениями считают состояния, при которых количество тромбоцитов в периферической крови составляет менее 150х109/л, тромбоцитозами — более 400х109/л, диапазоны 150-180х109/л и 320-400х109/л — «серая» зона. При сохраненной способности к адгезии и агрегации геморрагический синдром развивается лишь при количестве тромбоцитов менее 30х109/л, а угрожающие жизни спонтанные кровотечения в большинстве клинических ситуаций возможны при количестве тромбоцитов менее 15х109/л. Эти значения имеют условный характер, поскольку частота и выраженность геморрагий зависят от фонового заболевания и функциональной способности тромбоцитов.

Клиническое применение результатов исследования
Тромбоцитопении широко распространены в клинической практике и могут бы как наследственными, так и приобретенными. Их этиологию уточняют на основе жалоб, анамнестических, физикальных и лабораторных данных. Весьма важно начинать диагностический поиск с исключения вторичных форм тромбоцитопений, развивающихся вследствие нарушения выработки тромбоцитов в костном мозге (гипоплазий и аплазий костного мозга, лейкозов, аномалии Мея-Хегглина, синдрома Вискотта-Олдрича), уменьшения продолжительности их циркуляции при спленомегалиях (циррозе печени, синдроме Фелти, болезни Гоше, врожденных гемолитических анемиях, тромбозе селезеночной вены, некоторых инфекционных заболеваниях и др.), заболеваниях иммунного генеза (антифосфолипидном синдроме, лекарственных тромбоцитопениях, идиопатической тромбоцитопенической пурпуре) и при избыточном потреблении в ходе внутрисосудистой коагуляции (ДВС-синдроме, болезни Мошковича, гемолитико-уремическом синдроме).

Тромбоцитозы всегда носят приобретенный характер. Реактивные тромбоцитозы часто встречаются после спленэктомии, кровотечений, родов, гемолиза, хирургических вмешательств, а также на фоне онкологических, воспалительных или гнойных заболеваний. Исход подобных тромбоцитозов, как правило, благоприятный, их продолжительность зависит от особенностей фонового заболевания или состояния, а количество тромбоцитов не превышает 1000х109/л. Тромбоцитоз также возможен при миелопролиферативных заболеваниях (хроническом миелолейкозе, миелофиброзе, эссенциальной тромбоцитемии, эритремии, мегакариоцитарном лейкозе). Очень часто на фоне этих заболеваний наблюдаются нарушения реологических свойств крови и/или различные аномалии тромбоцитов. В последнем случае, а также при количестве тромбоцитов более 700х109/л у пациентов повышается риск возникновения тромбозов.

Время кровотечения
Определение длительности кровотечения является способом, позволяющим уточнить состояние сосудисто-тромбоцитарного звена системы гемостаза in vivo. Методический подход был впервые предложен Милианом в 1901 г. и модифицирован Дьюком в 1910 г. Все его варианты предполагают выполнение микроразреза кожного покрова с использованием скарификатора или другого стандартного режущего устройства (с ограничением глубины раны).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Ведущая роль в остановке кровотечений в зоне микроциркуляции (артериолах, прекапиллярах, капиллярах и венулах) принадлежит тромбоцитам. При снижении их количества или нарушении способности тромбоцитов к адгезии и агрегации часто наблюдается кровоточивость из мелких сосудов кожи и слизистых оболочек (микроциркуляторный тип кровоточивости). Такие клинические проявления очень часто сочетаются с удлинением времени кровотечения после выполнения стандартного микроразреза кожи.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕОСОБЕННОСТИ
В помещении, где выполняют исследование, температура должна быть не ниже 18 °С. При выполнении исследования методом Дьюка для улучшения кровотока рекомендуют согреть мочку уха между пальцами. Ряд медикаментов способен удлинить время кровотечения. В тех случаях, когда применялись лекарственные препараты, содержащие ацетилсалициловую кислоту, и другие нестероидные противовоспалительные средства, исследование должно быть отложено на 9-10 сут. Во избежание инфицирования место разреза обрабатывают 70% раствором этилового спирта. Важно дождаться полного испарения спирта в месте предполагаемого микроразреза, поскольку его попадание в рану приводит к преждевременной коагуляции. Результаты теста могут быть искажены под влиянием нестандартного скарификатора, неглубокого разреза кожи, наличия анемии, из-за особенностей кожных покровов пациента, эффекта преждевременного склеивания краев раны.

Определение длительности кровотечения in vivo
Существует несколько схожих методов для оценки длительности кровотечения, наилучшей воспроизводимостью и относительно малой травматичностью отличается метод Айви. Стандартизация в этом методе достигается одинаковой глубиной кожного разреза созданием стаза в венах верхней конечности путем наложения манжеты сфигмоманометра на плечо и поддержания в ней давления на уровне 40 мм рт.ст., что предупреждает преждевременное склеивание краев раны из-за коллапса венул в области разреза. В оригинальном варианте для получения достоверных результатов наносят три разреза и вычисляют среднее время кровотечения. Разработаны и широко используются специальные устройства для нанесения стандартного разреза кожи, такие как Simplate II (два разреза длиной 6 мм и глубиной 1 мм) или Triplett bleeding time device (5 и 1 мм соответственно). При достаточном навыке исследователя коэффициент вариации метода не превышает 10%.

Моделирование длительности кровотечения (исследование in vitro с помощью прибора PFA-100)
В последнее время появились образцы оборудования, способные оценивать адгезию и агрегацию тромбоцитов при прохождении цельной цитратной крови через искусственные капилляры, т. е. моделировать определение времени кровотечения in vitro (PFA-100). Это достигается регистрацией скорости образования тромбоцитарных агрегатов в исследуемой крови, проходящей через сменный картридж с капилляром и мембраной, на которой фиксированы коллаген и адреналин, и времени закрытия апертуры картриджа («closure time). При нарушении функции тромбоцитов, недостаточном их количестве и при болезни фон Виллебранда наблюдается удлинение времени формирования тромбоцитарной пробки. Коэффициент вариации метода не превышает 10%, но результаты зависят от гематокрита и количества тромбоцитов, что является относительным недостатком.

Приведенные варианты теста обладают невысокими диагностическими специфичностью (удлинение времени кровотечения после стандартного разреза кожи наблюдается при тромбоцитопении, тромбоцитопатии, авитаминозе С, болезни фон Виллебранда и др.) и чувствительностью (длительность кровотечения зачастую остается нормальной при тромбоцитопении, в ряде ситуаций до 50х109/л, и при легком течении болезни фон Виллебранда).

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Зависят от применяемой методики. В оригинальном методе Айви время кровотечения в норме не превышает 8 мин, но требуется уточнять нормативы применительно к каждой лаборатории, каждому лаборанту и типу применяемого устройства для надреза кожи. При моделировании определения длительности кровотечения in vitro с использованием цитратной крови средние нормальные значения не превышают 180 с для картриджа с коллагеном и аденозиндифосфатом, 250 с — для картриджа с коллагеном и адреналином.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты теста следует интерпретировать с учетом данных других анализов, а также наличия или отсутствия клинических геморрагических проявлений у обследуемого. Укорочение длительности кровотечения клинического значения не имеет и чаще свидетельствует о нестандартности процедуры или недостаточном опыте лаборанта. При тромбоцитопениях, тромбоцитопатиях и болезни фон Виллебранда время кровотечения удлиняется, при гемофилиях длительность кровотечения в большинстве случаев не отличается от нормы. Значительное удлинение времени кровотечения, не соответствующее выраженности тромбоцитопении, наблюдается при болезни Бернара-Сулье.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест используется как ориентировочный для выявления пациентов с нарушением сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза и болезнью фон Виллебранда; дифференцировать варианты патологии этим методом нельзя. Длительность кровотечения нередко бывает нарушена вследствие применения лекарственных препаратов, оказывающих влияние на функциональную способность тромбоцитов, но для контроля терапии антиагрегантами можно использовать только метод с моделированием определения длительности кровотечения in vitro.

Агрегационная функция тромбоцитов
РОЛЬ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
Способность тромбоцитов образовывать конгломераты служит основой формирования тромбоцитарной пробки, способствующей остановке кровотечения из мелких сосудов. Процесс формирования тромбоцитарных конгломератов протекает под действием индукторов агрегации. В физиологических условиях самым мощным индуктором агрегации тромбоцитов является тромбоксан А2, менее сильными, но не менее значимыми — аденозиндифосфат, адреналин, серотонин, гистамин, тромбин, коллаген и др. При моделировании агрегации в лабораторных условиях используют те же самые и некоторые дополнительные индукторы: аденозиндифосфат, адреналин, арахидоновую кислоту, тромбин, кальциевый ионофор А23187, коллаген, фибрин-мономер, бычий коагуляционный фактор VIII, ристоцетин и др. На практике наиболее часто используют аденозиндифосфат, адреналин, коллаген и ристоцетин.

Важнейшую роль в адгезии и агрегации играют рецепторные гликопротеиновые белки, встроенные в цитоплазматическую мембрану тромбоцитов. Рецепторы делятся на две основные группы — адгезивные и активационные. Рецепторы могут быть описаны и с помощью номенклатуры кластерной дифференциации в соответствии с антигенными свойствами и, таким образом, выявлены и классифицированы с использованием соответствующих CD-антител на проточном цитометре.

Вследствие структурной перестройки тромбоцитарной мембраны и многочисленных метаболических реакций активированные тромбоциты изменяют форму, у них появляются отростки, способствующие связыванию тромбоцитов между собой и образованию конгломератов. Собственно связующими звеньями служат фибриноген, реже фактор фон Виллебранда, фиксирующиеся на мембранных гликопротеинах GP IIb/IIIa. В процессе агрегации из тромбоцитов выделяются вещества, поддерживающие спазм сосудов в месте повреждения, вовлекающие в процесс другие тромбоциты и увеличивающие эффективность коагуляционных реакций.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Для определения агрегации тромбоцитов образцы венозной крови берут с цитратом натрия. Для пункции локтевой вены используются достаточно широкие иглы, через которые кровь самотеком попадает в пробирки с раствором цитрата; забирать кровь шприцем нельзя. При дозировании крови и цитрата следует учитывать значение гематокрита; при показателях менее 30 и более 55% коррекция соотношения объемов антикоагулянта и крови является обязательной, иначе результаты исследований будут искажены. Сразу после взятия кровь в пробирке тщательно перемешивают путем аккуратного переворачивания или вращения (без встряхивания). Температура при транспортировке образцов крови должна быть комнатной, поскольку при охлаждении происходят активация и агрегация клеток. Исследовать агрегацию тромбоцитов необходимо в течение 4 ч после взятия крови.

Для анализа используют богатую тромбоцитами плазму. При ее получении необходимо следить за фактором осаждения (150-200 g, 5-7 мин); завышенная скорость вращения центрифуги или слишком продолжительное время центрифугирования ведут к искажению результатов. Часть взятой крови или богатой тромбоцитами плазмы центрифугируют в более жестком режиме (1000 g, 15 мин) для получения бедной тромбоцитами плазмы, используемой для разведения и в качестве точки отсчета при оценке оптической плотности.

Перед анализом необходима стандартизация количества тромбоцитов в образце. Для этого проводят предварительный подсчет клеток в плазме на гематологическом анализаторе или микроскопическим методом. В соответствии с полученными результатами богатую тромбоцитами плазму разводят бедной тромбоцитами плазмой (от того же пациента) так, чтобы итоговое количество тромбоцитов в смеси составило 150-250х109/л. При тромбоцитопениях (менее 120х109/л) воспроизводимость результатов значительно снижается.

Очень важно спросить пациента о принимаемых лекарственных препаратах, поскольку ряд медикаментов способен нарушить агрегацию тромбоцитов. Если пациент принимал препараты, содержащие ацетилсалициловую кислоту, или нестероидные противовоспалительные средства, исследование должно быть отложено на 9-10 сут с момента отмены препарата.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Гемолиз в образце, относительный недостаток цитрата натрия при низких значениях гематокрита, неточное определение количества тромбоцитов и, как следствие, нестандартное их количество в образце ведут к погрешностям и плохой воспроизводимости результатов. Царапины на пробирках/кюветах также могут быть причиной неточностей из-за ошибок определения оптической плотности богатой и бедной тромбоцитами плазмы. Другой причиной аналитических ошибок может быть некачественная обработка магнитных мешалок при их повторном использовании, поэтому повторное использование пластиковых кювет и магнитных мешалок недопустимо. Высокая скорость вращения магнитной мешалки индуцирует спонтанную агрегацию тромбоцитов, что ведет к завышению результатов.

Оптический способ регистрации агрегации тромбоцитов
В основе записи агрегатограммы лежит принцип Борна, предполагающий графическую регистрацию изменения оптической плотности богатой тромбоцитами плазмы в процессе формирования тромбоцитарных агрегатов после добавления индуктора агрегации (аденозиндифосфата, адреналина, ристоцетина, коллагена и др.). Это наиболее распространенный вариант исследования, оценку тромбоцитарной агрегации осуществляют с помощью агрегометра. Несмотря на недостатки оптического метода, дифференциация нарушений агрегационной функции была разработана на основе именно его использования.

Лазерный способ
Агрегометром с использованием лазерного источника света измеряют светорассеяние, возникающее при попадании в луч тромбоцитарных конгломератов. Имеется возможность оценки радиуса агрегатов, а также спонтанной агрегации тромбоцитов при механическом воздействии (вращении магнитной мешалки) без добавления индуктора. Таким образом, появляется дополнительная возможность оценки гиперагрегации тромбоцитов, хотя общепризнанного стандартизированного метода пока нет. У таких приборов сохраняется возможность использования стандартного метода Борна. 

Импедансный способ
Агрегометром с импедансным принципом регистрации определяют изменения электрических свойств цельной крови при добавлении стимуляторов агрегации. Именно поэтому из исследования исключаются этапы приготовления бедной и богатой тромбоцитами плазмы и подгонки количества тромбоцитов к стандартному уровню, что значительно сокращает время анализа и снижает количество ошибок. Графики, полученные при исследовании агрегации тромбоцитов этим способом, схожи с аналогичными «оптическими» кривыми агрегации, но временные показатели волн агрегации и их амплитуды не совпадают. Степень агрегации оценивается как электрическое сопротивление.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Вследствие отсутствия общепринятых диапазонов нормальных значений при измерении агрегационной функции тромбоцитов каждая лаборатория определяет нормативы самостоятельно.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Оценка показателей агрегации тромбоцитов зависит от метода регистрации этого процесса. В наиболее распространенном оптическом способе лучшую воспроизводимость демонстрируют степень агрегации (%) и угол наклона кривой. Применение низких концентраций стимуляторов агрегации дает возможность раздельно оценить первую и вторую волны агрегации, а иногда — выявить гиперагрегацию тромбоцитов. Большую ценность имеет информация о наличии или отсутствии второй волны агрегации, поскольку именно она на агрегатограмме отражает реакцию высвобождения содержимого а-гранул и плотных тромбоцитарных гранул. Для корректной интерпретации результатов желательно использовать несколько стимуляторов агрегации.

Интерпретация результатов бывает затруднена при дифференциации геморрагических состояний от сходных нарушений фазы адгезии и агрегационной функции тромбоцитов — болезни фон Виллебранда и синдрома Бернара-Сулье. В этом случае при добавлении в исследуемую богатую тромбоцитами плазму нормальной бестромбоцитарной плазмы или криопреципитата у больных с болезнью фон Виллебранда ристоцетиновая агрегация восстанавливается, а при синдроме Бернара-Сулье — не исправляется.
Результаты исследования следует интерпретировать с учетом клинического статуса пациента. При геморрагическом синдроме и отсутствии нарушений агрегации тромбоцитов необходимо повторное исследование через 1-1,5 мес. При изменениях агрегации, характерных для синдрома Бернара-Сулье, тромбастении Гланцманна и другой патологии, также необходимо повторно исследовать агрегационную функцию тромбоцитов. При некоторых аномалиях тромбоцитов (синдромах Мея-Хегглина, Фехтнера, Скотта, отсутствии GP IV) агрегационная функция клеток не нарушена.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Назначая тест и оценивая результаты исследования функции тромбоцитов, необходимо иметь в виду следующие принципиальные моменты:
• индуцированная агрегация тромбоцитов значительно полезнее при выявлении недостаточной функциональной способности тромбоцитов, чем при их гиперактивности;
• наследственные тромбоцитопатии встречаются очень редко, а именно распространенность заболевания имеет подчас решающее значение для информативности метода;
• до настоящего времени не существует окончательных международных рекомендаций и стандартов по выявлению гиперактивности тромбоцитов; 
• решающий вклад в результаты могут вносить особенности и ошибки на преаналитическом этапе.

Приобретенные нарушения агрегации тромбоцитов в клинической практике встречаются довольно часто и бывают более выраженными на фоне применения ацетилсалициловой кислоты, других нестероидных противовоспалительных препаратов и анальгетиков. Нарушения также возможны при лечении p-адреноблокаторами, антагонистами кальция, ксантинами и некоторыми другими препаратами, а также на фоне ряда заболеваний (почечной недостаточности, гемобластозов, интоксикаций и др.). Алкоголь и продукты питания, содержащие уксусную кислоту и другие консерванты, также способны нарушить агрегацию тромбоцитов.

Кривая агрегации тромбоцитов у здорового человека, полученная на оптическом агрегометре, часто (но не всегда) имеет двухфазный вид. При дефектах высвобождения (дефиците плотных гранул, нарушении механизма секреции) возможны отсутствие второй волны и снижение агрегации с арахидоновой кислотой. Сходные нарушения наблюдаются при ряде заболеваний (синдромах Хержманского-Пудлака, Чедиака-Хигаси, Вискотта-Олдрича, TAR-синдроме). Нарушение агрегации тромбоцитов, индуцируемой ристоцетином, служит частым лабораторным проявлением болезни фон Виллебранда. Синдром «серых» тромбоцитов характеризуется нарушением коллагеновой и тромбиновой агрегации в сочетании с наличием больших тромбоцитов. При редко встречающихся наследственных дефектах тромбоцитарных гликопротеинов (тромбастении Гланцманна, синдроме Бернара-Сулье и др.) наблюдаются нарушение адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов и, как следствие, развитие рецидивирующего геморрагического синдрома. При синдроме Бернара-Сулье нарушение ристоцетиновой агрегации часто сочетается с тромбоцитопенией (чаще до 50х109/л) и значительным увеличением размера тромбоцитов. Дифференциальная диагностика вариантов нарушения тромбоцитарной функции основана на оценке агрегации тромбоцитов с различными индукторами.

Фактор фон Виллебранда
ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ
Фактор фон Виллебранда принадлежит к семейству адгезивных белков, является крупным мультимером, состоящим из 50-100 одинаковых субъединиц, имеет большую молекулярную массу (от 500 тыс. до 20 млн Да); адгезив- ность мультимеров тем выше; чем больше их молекулярная масса. Синтез этого белка осуществляется в эндотелиальных клетках и мегакариоцитах, димеры и мультимеры формируются из субъединиц с помощью дисульфидных связей. Мультимеры фактора фон Виллебранда хранятся в а-гранулах тромбоцитов и тельцах Вибеля-Палада эндотелиальных клеток, откуда попадают в кровь. Циркулирующие в сосудистом русле мультимеры фактора фон Виллебранда расщепляются на олигомеры, димеры и мономеры метал- лопротеиназой.

Фактор фон Виллебранда, связываясь с коагуляционным фактором VIII, защищает его от протеолиза, а также служит кофактором адгезии тромбоцитов к компонентам субэндотелия (коллагеновым волокнам, микрофибриллам), имеющим центры связывания этого мультимерного белка.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Содержание фактора фон Виллебранда определяется в бедной тромбоцитами цитратной плазме. При нормальных значениях гематокрита можно использовать вакуумные системы взятия крови, при значительном отклонении гематокрита от нормы венозную кровь самотеком набирают в пробирку с соответствующим количеством раствора цитрата натрия. Немедленно после взятия крови содержимое пробирки тщательно перемешивают без встряхивания и при комнатной температуре транспортируют в лабораторию. Бедную тромбоцитами плазму получают центрифугированием крови при 1000-1200 g 15 мин.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Гемолиз в образце, относительный недостаток цитрата натрия при низких значениях гематокрита ведут к погрешностям и плохой воспроизводимости результатов. Концентрация фактора фон Виллебранда может возрастать после физических упражнений, при стрессовых ситуациях, беременности, кровотечениях, инфекционных заболеваниях, терапии эстрогенами. У женщин в разные фазы месячного цикла возможны колебания уровня фактора фон Виллебранда; для стандартизации интерпретации данных некоторые эксперты рекомендуют для определения фактора фон Виллебранда у женщин брать кровь на 5-7-е сутки менструального цикла.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ, МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Фактор фон Виллебранда отличается большим разнообразием аномалий, поэтому для диагностики болезни фон Виллебранда используют комплекс тестов. Базовые методы исследования предназначены для выявления дефицита или качественных аномалий фактора фон Виллебранда; они основаны на иммуноферментных технологиях и определении агрегации фиксированных нормальных тромбоцитов с ристоцетином при добавлении исследуемой бедной тромбоцитами плазмы.

Концентрация фактора фон Виллебранда
Основной метод определения концентрации фактора фон Виллебранда — твердофазный иммуноферментный анализ, чувствительность определения — 2% медианы референтного значения, коэффициент вариации — не более 10% (обычно 5-7%). Возможно определение фактора фон Виллебранда с помощью ракетного иммуноэлектрофореза, а также иммунотурбидиметрии (с суспензией микрочастиц, покрытых специфическими анти-ФВ-антителами; коэффициент вариации — 2-5%).

Ристоцетин-кофакторная активность фактора фон Виллебранда
Обработанные формалином тромбоциты теряют способность к образованию агрегатов в ответ на действие большинства индукторов, однако добавка ристоцетина и исследуемой плазмы во взвесь таких тромбоцитов обычно приводит к их быстрой агрегации. Ее выраженность прямо зависит от наличия фактора фон Виллебранда в плазме, поэтому при снижении концентрации этого протеина или его качественной неполноценности агглютинация выражена слабо или вовсе отсутствует. Для количественного определения ристоцетин-кофакторной активности необходим агрегометр; полуколичественный метод предполагает визуальную оценку времени появления агрегатов в смеси разведенной исследуемой плазмы, ристоцетина и обработанных формалином тромбоцитов. Коэффициент вариации обоих методов — не более 10%. 

Активность плазменного фактора VIII
Поскольку в норме фактор фон Виллебранда, образуя комплекс с коагуляционным фактором VIII, защищает его от протеолиза, при многих вариантах болезни фон Виллебранда активность фактора VIII из-за быстрой деградации снижается. Для определения содержания фактора VIII оценивают время свертывания смеси дефицитной по этому фактору субстратной плазмы, АЧТВ-реагента и разведенной исследуемой плазмы после инкубации и добавления кальция хлорида. Результаты исследования важны для диагностики субтипа 2N болезни фон Виллебранда, поскольку при этом варианте патологии значительно снижается активность антигемофильного глобулина.

Коллагенсвязывающая активность фактора фон Виллебранда
Адгезия тромбоцитов к коллагеновым волокнам субэндотелия реализуется через мембранный рецептор GP Ib-V-IX в присутствии фактора фон Виллебранда, поэтому при аномалиях этого мультимерного протеина или его недостаточном количестве связывание тромбоцитов с коллагеном нарушается. Для определения коллагенсвязывающей активности используют модифицированный метод иммуноферментного анализа, в котором фактор фон Виллебранда, содержащийся в исследуемом материале, фиксируется в покрытых коллагеном лунках планшета и впоследствии связывается с конъюгатом антител к фактору фон Виллебранда пероксидазой. После отмывки и добавления хромогенного субстрата появляется окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству и коллагенсвязывающей способности фактора фон Виллебранда в исследуемом образце. Несмотря на то что метод определения коллагенсвязывающей активности является иммунологическим, его результаты свидетельствуют о функциональной активности фактора фон Виллебранда. Коэффициент вариации метода не превышает 15%.

Агрегация тромбоцитов с ристоцетином
Нарушение агрегации тромбоцитов, индуцируемой ристоцетином, является частым лабораторным признаком болезни фон Виллебранда, в частности типа 2В, при котором наблюдается аномально высокая агрегация в ответ на добавление низких концентраций ристоцетина. При других аномалиях фактора фон Виллебранда этот метод имеет вспомогательное значение, поскольку агрегация с обычной концентрацией ристоцетина может быть нарушена при различных вариантах заболевания. Воспроизводимость исследования ристоцетиновой агрегации зависит от модели агрегометра и профессиональной подготовки персонала.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
В настоящее время доступны контрольные материалы с аттестованными значениями концентрации фактора фон Виллебранда. Учитывая различие методик определения этого протеина, необходимо тщательно выверить вариант исследования, для которого был аттестован контрольный образец.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Диапазон концентраций и активности фактора фон Виллебранда у здоровых людей довольно широк; нормативы зависят от варианта методики, оборудования, группы крови, реактивов и т. д. Референтные пределы указываются в инструкции к наборам реагентов, но многие производители диагностических наборов, особенно основанных на тромбоцитарной агрегации, рекомендуют лабораториям самим установить собственный диапазон нормальных значений. У пациентов с I группой крови уровень фактора фон Виллебранда примерно на 10% ниже, чем при других группах крови, и это нужно учитывать при диагностике болезни фон Виллебранда.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты исследования концентрации и активности фактора фон Виллебранда следует интерпретировать с учетом данных, полученных разными методами, а также (что очень важно) с учетом клинических проявлений заболевания у пациента и анализа наследственности.

При 1-м типе этого заболевания наблюдается количественный дефект фактора фон Виллебранда, поэтому бывают сниженными результаты иммунологических и функциональных методов его определения. При 2-м типе синтезируются аномальные молекулы фактора, поэтому иммунологические методы часто показывают нормальное содержание фактора фон Виллебранда, а данные функциональных тестов, основанные на агрегации тромбоцитов с ристоцетином, значимо нарушены. Многие лабораторные методики при разных типах заболевания демонстрируют сходные результаты. Для более эффективной дифференциации качественных и количественных нарушений ранее был предложен показатель соотношения (Ratio) ристоцетин-кофакторной активности и концентрации антигена фактора фон Виллебранда; снижение этого показателя менее 0,7 свидетельствует о 2-м типе болезни фон Виллебранда.

При дифференциации субтипов заболевания необходимо учитывать следующие особенности:
• низкие показатели ристоцетиновой агрегации часты при количественном дефекте и субтипах качественного нарушения 2А и 2М;
• высокая ристоцетиновая агрегация тромбоцитов малыми дозами индуктора за счет увеличения аффинности фактора фон Виллебранда к рецептору GP Ib характерна для субтипа 2В;
• нормальные показатели ристоцетиновой агрегации тромбоцитов и значительное нарушение связывания фактора фон Виллебранда с фактором VIII, что проявляется существенным снижением активности фактора VIII, бывают при субтипе 2N заболевания (нередко снижение фактора VIII при этом субтипе настолько выражено, что приходится дифференцировать заболевание от гемофилии А);
• тромбоцитарный вариант болезни фон Виллебранда, схожий по клинико-лабораторным проявлениям с субтипом 2М, является следствием мутации a-цепи GP lb (при этом нарушении повышена аффинность аномального тромбоцитарного рецептора к высокомолекулярным мультимерам фактора фон Виллебранда, вследствие чего концентрация этого протеина снижается);
• дополнительную информацию дает исследование мультимерности фактора фон Виллебранда.

При 1-ми 3-м типе болезни исследовать мультимерность фактора фон Виллебранда нет необходимости, поскольку результаты предсказуемы. Но при А- и В-вариантах 2-го типа заболевания это исследование помогает выявить тип нарушения мультимерности, что необходимо при дифференциации заболевания. Повышение концентрации фактора фон Виллебранда свидетельствует о дисфункции эндотелия или его повреждении при сердечно-сосудистой и других видах патологии.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Оценка фактора фон Виллебранда может быть использована при двух принципиально различных ситуациях — дифференциальной диагностике болезни фон Виллебранда и оценке эндотелиальной дисфункции.

Диагностика болезни фон Виллебранда — задача, требующая дорогостоящего оборудования, значительного времени и профессиональных навыков. Тем не менее это очень важно, поскольку при данной патологии в ряде случаев существенно ухудшается качество жизни пациентов, а в других ситуациях это заболевание неожиданно проявляется массивными, нередко угрожающими жизни геморрагиями во время операций, родов, при травмах и других состояниях у пациентов, считавших себя здоровыми. Имеются сообщения о гибели больных от неконтролируемого кровотечения при этой патологии. Наиболее часто опасные для жизни кровотечения наблюдаются при 3-м типе заболевания.
Знание типа болезни фон Виллебранда дает возможность выбора терапии, посколь-ку некоторые гемостатические препараты обладают разной эффективностью при лечении и профилактике кровотечений у пациентов с различными вариантами этого заболевания. Например, препараты на основе DDAVP дают неплохие результаты при 1-м типе заболевания, противопоказаны при субтипе 2В и бесполезны при 3-м типе.

Использование фактора фон Виллебранда в качестве маркера эндотелиальной дисфункции основано на факте, что фактор фон Виллебранда синтезируется и хранится в клетках сосудистой выстилки, повреждение эндотелия практически всегда сопровождается повышением содержания фактора фон Виллебранда в плазме крови. В этом случае информативно только исследование антигена фактора фон Виллебранда, отражающего его концентрацию. Повышение содержания фактора фон Виллебранда может отражать негативные прогностические тенденции при сердечно-сосудистой патологии, сахарном диабете, патологии почек, гестозах и других заболеваниях.

b-Тромбоглобулин
ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВА
Тромбоглобулины — группа иммунологически идентичных протеинов, отличающихся друг от друга лишь количеством аминокислотных остатков в цепи. В мегакариоцитах и неактивированных тромбоцитах содержатся два основных вещества из этой группы — РВР и CTAP-III. Еще один представитель этой группы веществ — p-тромбоглобулин — в интактных тромбоцитах отсутствует и образуется в них лишь после активации и агрегации.

РОЛЬ b-ТРОМБОГЛОБУЛИНА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ
p-Тромбоглобулин (р-ТГ) появляется в крови в результате высвобождения из а-гранул тромбоцитов, где он накапливается и хранится. Окончательно физиоло¬гическая роль этого протеина не определена; имеются сведения о его способности тормозить образование простациклина, выступать в качестве регулятора функции гранулоцитов при повреждении сосуда и служить мощным хемоаттрактантом для фибробластов.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Должны быть приняты меры для предупреждения активации тромбоцитов при взятии и обработке образцов крови. За день до сдачи крови пациенту следует избегать стрессов, физических нагрузок, приема алкоголя, смены режима дня и изменений в питании. Кровь берут утром натощак (не менее чем через 8 ч после последнего приема пищи), в спокойном состоянии пациента. Перед венепункцией пациенту рекомендуют отдых в течение 20-30 мин. Венозный стаз перед венепункцией должен быть максимально ограничен, вакуумные пробирки не применяют. Для пункции вены используют иглы с широким просветом (не менее 21G) для того, чтобы кровь могла идти самотеком; первые 3-4 мл для анализа не используют.

Кровь набирают в специальные пробирки со стабилизатором CTAD (цитрат натрия, аденозин, теофиллин и дипиридамол). Для того чтобы избежать влияния вакуума и турбулентности на образец крови, рекомендуют открыть пробирку для уравновешивания давления, наложить жгут только для поиска вены, пунктировать вену иглой, удалить первые 2 мл крови, только после этого собрать необходимый объем крови самотеком в пробирку. Пробирку с кровью немедленно помещают на тающий лед и дают ей охладиться не менее 15 мин. Центрифугирование проводят не позднее 1 ч после взятия крови в криоцентрифуге при температуре 2-8 °С в течение 20 мин при 2500 g. Из средней части пробирки отбирают 1/3 объема супернатанта для повторного центрифугирования в тех же условиях и получения бестромбоцитной плазмы, используемой для исследования. Все эти меры предназначены для того, чтобы избежать активации тромбоцитов на преаналитическом этапе, а также исключить попадание в исследуемый образец обломков клеток. Образцы плазмы можно хранить при комнатной температуре в течение 4 ч, при -20 °С — не более 4 нед; оттаивание замороженной плазмы проводят на водя¬ной бане при 37 °С в течение 20 мин.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Ложное завышение уровня р-ТГ возможно в образцах плазмы, содержащих клетки (такие образцы следует повторно отцентрифугировать) или высокие уровни липидов. Результаты исследования часто завышаются при почечной недостаточности. Уровень р-ТГ может также изменяться при тромбоцитозах и тромбоцитопениях. Причиной неточных результатов и ошибок исследования может быть несоблюдение температурного режима при хранении реагентов.

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ, МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
В основе определения р-ТГ лежит принцип твердофазного иммуноферментного анализа со связыванием антигена и антител, поэтому специфичность и чувствительность достаточно высоки. Коэффициент вариации не превышает 15%. 

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Не более 80 мкг/л, или 10-50 МЕ/мл (зависит от метода исследования). В некоторых лабораториях верхняя граница нормальных значений может быть иной; возможно сформировать контрольную группу и самостоятельно определить диапазон нормальных значений.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
р-ТГ — один из наиболее чувствительных и объективных маркеров активации тромбоцитов, можно использовать в оценке тромбофилических состояний наряду с маркерами активации свертывания. Уровень р-ТГ повышается при стимуляции тромбоцитов in vivo и in vitro коллагеном, иммунными комплексами и другими веществами, способными вызвать агрегацию. Низкие значения уровня р-ТГ могут служить вспомогательным диагностическим критерием дефицита тромбоцитарных а-гранул. При тромбоцитопениях и тромбоцитозах уровень р-ТГ зависит от количества тромбоцитов.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
Определив повышение уровня р-ТГ в плазме, можно установить гиперагрегацию тромбоцитов при различных патологических состояниях — инфаркте миокарда, венозном тромбоэмболизме, искусственных клапанах сердца, периферических рас-стройствах кровообращения, сахарном диабете, раке и др. Применение антиагрегантов снижает концентрацию р-ТГ, поэтому тест можно использовать в качестве дополнительного для контроля эффективности лечения этими препаратами.

11-дегидротромбоксан В2
ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ И СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВА
Тромбоксан А2 — представитель группы простагландинов, синтезируемый в раз-личных клетках организма, в том числе и в тромбоцитах. Период полужизни этого вещества составляет около 30 с, поэтому мониторинг продукции тромбоксана А2 in vivo обычно проводят косвенно, по определению тромбоксана В2 в плазме крови, или более стабильного метаболита - 11-дегидротромбоксана В2 в моче.

РОЛЬ ТРОМБОКСАНА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ
Предшественником тромбоксана А2, как и ряда других простагландинов и лей- котриенов, служит арахидоновая кислота, накапливаемая в клетках при актива¬ции фосфолипаз. Под действием циклооксигеназы-1 арахидонат превращается в короткоживущие простагландины и далее — в тромбоксан А2 при участии тромбоксансинтетазы. Образуемый и высвобождаемый тромбоксан А2 вызывает быструю необратимую агрегацию тромбоцитов и дополнительный спазм сосудов малого калибра. При метаболизме этого вещества в печени образуется тромбоксан В2, далее — 11-ДГТ В2, удаляемый из организма с мочой.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Концентрацию 11-ДГТ В2 наиболее часто исследуют в утренней порции мочи. До ее сдачи пациенту следует избегать стрессов, физических нагрузок, приема алкоголя, смены режима дня и изменений в питании. Для предупреждения образования тромбоксана и его метаболитов in vitro в образцы мочи можно добавлять ингибиторы простагландинсинтетаз (индометацин). Для дозирования образцов важно использовать одноразовые наконечники.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
В образцах мочи, содержащих лейкоциты и эритроциты, возможно ложное завышение уровня 11-ДГТ; такие образцы следует отфильтровать либо повторно центрифугировать. Другие возможные причины неточностей и ошибок — несоблюдение температурного режима при хранении реагентов и засорение каналов промывателей.

МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для определения 11-ДГТ используют радиоиммунный анализ с меткой 1251, а также твердофазный иммуноферментный анализ. Аналит в исследуемом биоматериале и добавляемый конъюгат 11-ДГТ с щелочной фосфатазой конкурентно связываются с поликлональными антителами в лунках микропланшета; после промывки, добавления хромогенного субстрата, инкубации и остановки реакции определяется степень окраски, обратно пропорциональная содержанию 11-ДГТ в пробе. При исследовании мочи во избежание эффекта разведения в ней одновременно определяют концентрацию креатинина, результат выражают в пересчете на ммоль или грамм креатинина.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
У здоровых людей диапазон концентраций 11-ДГТ в моче составляет 40-240 нг/ммоль креатинина (350-2100 нг/г креатинина). При возможности рекомендуют сформировать контрольную группу и самостоятельно определить диапазон нормальных значений для каждой лаборатории.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Уровень 11-ДГТ В2 служит наиболее объективным биохимическим показателем аспиринрезистентности, о чем свидетельствуют высокие значения аналита в моче на фоне лечения препаратами, содержащими ацетилсалициловую кислоту. О чувствительности к аспирину может свидетельствовать 50% снижение уровня 11-ДГТ в моче на фоне приема внутрь 325 мг аспирина в сутки.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Значение определения 11-ДГТ в моче для оценки чувствительности к аспирину описано в разделе, посвященном лабораторному контролю антитромботической терапии. Кроме того, определение 11-ДГТ В2 можно использовать для оценки активации тромбоцитов при разных заболеваниях. Доказана связь высоких значений аналита в моче с развитием осложнений атеросклероза — инфарктов, инсультов и др., в том числе у пациентов, получающих антиагрегантную терапию.

Оцените статью: (10 голосов)
3.8 5 10

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Методы исследования коагуляционного гемостаза. Часть 1
Методы исследования коагуляционного гемостаза. Часть 2
Основы функционирования системы гемостаза
Плазменное звено гемостаза
Преаналитический этап исследований гемостаза


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти