MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Методы исследования коагуляционного гемостаза. Часть 2

Антитромбин (активность/количество)
В 30-е гг. XX в. при изучении антикоагулянтных свойств плазмы было показано, что активность тромбина в ней может снижаться различными веществами, получившими название «антитромбины». Фибрин, абсорбирующий тромбин, был назван антитромбином I, гепариновый кофактор — антитромбином И, а термин «антитромбин III» (единственный из реально сохранившихся) применяли для обозначения ингибитора сериновых протеаз, наиболее активно блокирующего тромбин и фактор Ха. В настоящее время как синоним антитромбина III чаще используют термин «антитромбин».

Антитромбин — основной естественный ингибитор свертывания крови, первичный антикоагулянт. В присутствии гепарина антитромбин связывает и инактивирует тромбин и другие активные плазменные факторы — сериновые протеазы, предотвращая неконтролируемую коагуляцию. 

Активность антитромбина в исследуемой плазме определяют по его способности инактивировать вносимый извне тромбин.


При определении клоттинговым методом исследуемую плазму дефибринируют путем прогревания при 56 °С, быстрого охлаждения до 20-25 °С и центрифугирования с отбрасыванием осадка, вносят в стандартный раствор тромбина и инкубируют при 37 °С. Далее эту смесь добавляют к стандартной нормальной плазме (или к стандартному раствору фибриногена) и определяют время образования фибринового сгустка на коагулометре или в водяной бане при периодическом покачивании пробирки. Активность антитромбина находят по калибровочному графику, для построения которого проводят определение времени образования сгустка при аналогичной обработке ряда последовательных разведений контрольной нормальной плазмы с известной активностью антитромбина.

При использовании хромогенного метода в исследуемую плазму, разведенную буферным раствором с гепарином для активации антитромбина, вносят стандартное количество фактора Ха (На) и инкубируют при 37 °С.


Затем в реакционную смесь вводят хромогенный субстрат, по истечении определенного времени останавливают реакцию добавлением уксусной кислоты и определяют оптическую плотность исследуемых образцов при А,=405 нм против бланка (буферный раствор, инкубируемый одновременно с пробой). Активность антитромбина в исследуемой плазме находят по калибровочному графику, для построения которого по описанной выше схеме проводят определение ряда последовательных разведений плазмы-калибратора с известным содержанием антитромбина. Возможно количественное определение антитромбина (антигена) иммунохимигескими методами: иммуноферментный анализ, иммунохемилюминесцентным анализом и др. Методы стандарти¬зированы, могут быть выполнены на автоанализаторах и дают хорошо воспроизводимые результаты, но не позволяют судить об антикоагулянтной (гепарин-кофакторной) активности антитромбина.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. Исследование проводят в течение 2-4 ч после взятия крови; при необходимости возможно однократное замораживание-оттаивание плазмы. Не допускается наличия в материале сгустков и следов гемолиза. Липемия также может повлиять на результаты хромогенного теста.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
При определении клоттинговым методом плазму пациентов, которым накануне взятия крови вводили гепарин, предварительно обрабатывают сорбентом во избежание искажения результатов. В то же время при использовании препарата тромбина, содержащего инактиваторы гепарина, и при условии, что концентрация гепарина в плазме крови пациента не превышает 1 МЕ/мл, предварительное его удаление из плазмы сорбентом не является обязательным. При исследовании хромогенным методом образцов плазм с повышенным содержанием липидов (мутноватых) и билирубина (иктеричных) могут быть получены заниженные результаты.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 70-130% уровня нормальной плазмы.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Проверку методики проводят путем исследования стандартной контрольной плазмы или свежей пулированной плазмы от нескольких здоровых людей. Для контроля качества используют референтную нормальную пулированную плазму (РНП-плазма), срок ее годности — 2ч после разведения лиофилизированного препарата. Для обеспечения точности результатов при исследовании клоттинговым методом рекомендуют проводить определение на коагулометре, хромогенным методом — на фотометре, биохимическом анализаторе или анализаторе гемостаза с фотометрическим каналом.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Уровень антитромбина может быть снижен при врожденной недостаточности (возможно снижение как функциональной активности, так и концентрации антитромбина), при диссеминированном внутрисосудистом свертывании, поздних гестозах, тяжелых поражениях печени, приеме эстрогенов и пероральных контрацептивов, а также при лечении L-аспарагиназой и длительном применении больших доз гепарина (образуются активные комплексы «гепарин-АТ», относительно быстро уходящие из кровотока). Контроль активности антикоагулянтной системы плазмы в целом и антитромбина в частности необходим при тромбозах, тромбофилических состояниях, диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови и ряде лекарственных воздействий. При выраженном снижении уровня антитромбина значительно увеличивается риск развития тромбозов; срочная коррекция этого состояния осуществляется путем инфузии препаратов антитромбина или свежезамороженной плазмы. Некоторое повышение уровня антитромбина в крови вследствие ускорения синтеза в печени возможно при беременности и во время менструации.

Протеин С (активность/количество)
Протеин С — важнейший ферментный фактор антикоагулянтной системы. Он синтезируется печенью (синтез зависит от витамина К) и постоянно циркулирует в крови в неактивном виде. После активации комплексом «тромбин-тромбомодулин» на поверхности неповрежденных эндотелиальных клеток и тромбоцитов рассеянного склероза в присутствии своего кофактора — протеина S — частично разрушает неферментные плазменные факторы Va и Villa, сдерживая активность коагуляционных процессов. Имеются данные об участии рассеянного склероза в активации фибринолиза.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Протеин С, содержащийся в исследуемой плазме, переходит в активное состояние после добавления специфического неферментного активатора из змеиного яда. При использовании коагуляционного (клоттингового) метода об активности рассеянного склероза судят по степени удлинения активированного частичного тромбопластинового времени в смеси дефицитной по рассеянному склерозу и исследуемой плазмы, в которой при активации рассеянного склероза происходят частичное расщепление факторов Va и Villa и уменьшение скорости коагуляционных реакций по сравнению с «чистой», дефицитной по протеину С субстратной плазмой, в которой удлинения активированного частичного тромбопластинового времени в тех же условиях практически не бывает. В хромогенном методе определяют скорость расщепления пептидного хромогенного субстрата активированным протеином С, содержащимся в исследуемой плазме; количество высвобождающегося при этом красителя прямо пропорционально активности рассеянного склероза. Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. Исследование проб должно быть проведено не позднее 2-4 ч после получения. Для более длительного хранения допускается однократное замораживание плазмы при -20 °С; оттаивание следует проводить быстро (в теплой воде), последующий анализ — в течение 1 ч. Не исследуют плазму, содержащую гепарин, имеющую сгустки и следы гемолиза.

МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
При исследовании клоттинговым методом готовят смесь разведенной буферным раствором исследуемой плазмы, активатора протеина С и дефицитной по субстратной плазмы, инкубируют ее при 37 °С и определяют активированное частичное тромбопластиновое время, добавляя кальция хлорид. Количественный расчет результатов проводят по калибровочному графику, для построения которого используют разведения буфером (от 1:5 до 1:40) стандартной плазмы с известной активностью, подставляя эти калибровочные пробы взамен разведенной исследуемой плазмы и определяя их активированное частичное тромбопластиновое время с помощью коагулометра или вручную. Все исследования проводят в дублях, рассчитывая среднее значение.

При хромогенном методе в исследуемую плазму добавляют активатор протеина С и инкубируют при 37 °С. Затем в реакционную смесь вводят хромогенный субстрат, по истечении определенного времени останавливают реакцию добавлением кислоты и определяют оптическую плотность исследуемых образцов при А,=405 нм против бланка (буферный раствор, инкубируемый одновременно с пробой). Активность PC в исследуемой плазме находят по калибровочному графику, для построения которого по той же схеме проводят определение стандартной плазмы-калибратора и ряда ее последовательных разведений. Дополнительные условия построения калибровочного графика и диапазон линейности определяются фирмой-производителем.

Иммуноферментное определение проводят на планшетах с фиксированными моноклональными антителами, с которыми связывается PC из добавляемой исследуемой плазмы. После отмывки и добавления конъюгата анти-РС-антител с пероксидазой образуются «сэндвич»-структуры, которые окисляют хромогенный субстрат при инкубации с перекисью водорода. Степень окраски реакционной среды, зависящая от количества PC в образце плазмы, определяется спектрофотометрически при > или =450 нм. Расчет проводят по калибровочному графику, построенному по данным исследования ряда разведений референтной плазмы.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 70-140% уровня нормальной плазмы.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
При лечении непрямыми антикоагулянтами (варфарином) у больных возможно появление форм PC, не обладающих антикоагулянтным действием, хотя их активность, определяемая хромогенным методом, оказывается нормальной или завышенной. В этих условиях корректные данные дает клоттинговый тест, но его результаты могут оказаться заниженными при возрастании уровня фактора VIII в плазме крови. При исследовании образцов плазмы больных с повышенным содержанием липидов (мутноватых) и билирубина (иктеричных), а также при наличии у пациентов волчаночного антикоагулянта и после введения гепарина показатели активности протеина С могут завышаться. После введения ингибиторов сериновых протеаз (апротинина и др.) активность PC снижается. 

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют специальную контрольную плазму с аттестованной активностью PC. Для обеспечения точности результатов в клоттинговом тесте рекомендуют проводить определение на коагулометре, при исследовании хромогенным методом — на фотометре, биохимическом анализаторе или анализаторе гемостаза с фотометрическим каналом.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Уменьшение активности и/или концентрации PC свидетельствует о нарушениях его синтеза (врожденной недостаточности, периоде новорожденности и пожилом возрасте, тяжелой патологии печени), либо о быстром расходовании, либо об аномалиях структуры и функциональной неполноценности (действие варфарина). Очень низкие показатели активности PC могут наблюдаться на фоне лечения варфарином. Небольшое повышение содержания протеина С возможно при беременности и приеме эстрогенных препаратов, а также при некоторых заболеваниях почек.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Врожденная недостаточность PC является тромбофилическим состоянием и требует профилактических мер для предупреждения тромбозов. Снижение активности протеина С до 50% нормы и ниже на фоне терапии антикоагулянтами непрямого действия может приводить к кожным некрозам (варфариновым некрозам), которые встречаются нечасто, но протекают тяжело. В связи с этим использование непрямых антикоагулянтов у пациентов с дефицитом PC следует проводить с особой осторожностью под контролем активности протеина С; при необходимости — с восполнением его дефицита свежезамороженной плазмой или препаратом рекомбинантного PC.

Резистентность фактора V к активированному протеину С
Роль анализа в физиологигеских процессах. Протеин С, активируемый комплексом «тромбин-тромбомодулин», вызывает частичную деградацию плазменных факторов Villa и Va и ограничивает скорость коагуляционных реакций. Если же у пациента структура фактора V изменена вследствие мутации, его деградация активным PC замедляется или прекращается, что ведет к возрастанию плазменной концентрации фактора V и развитию тромбофилического состояния.

Характеристика теста. Активированный препаратом змеиного яда протеин С из дефицитной по фактору V субстратной плазмы разрушает фактор Va в добавляемой исследуемой плазме, причем скорость и полнота распада фактора Va зависят от его структуры (нормальной или измененной вследствие мутации). Снижение уровня данного фактора вследствие его распада обычно приводит к существенному удлинению активированного частичного тромбопластинового времени; если же в исследуемой плазме он резистентен к действию активированного протеина С, удлинение активированного частичного тромбопластинового времени будет менее выраженным.

Методика исследования. Оригинальный метод, предложенный в 1993 г., заключается в определении активированного частичного тромбопластинового времени неразведенной плазмы с добавлением активированного протеина С и без него и последующем расчете аРС-отношения, которое показывает степень удлинения активированного частичного тромбопластинового времени под действием аРС:

отношение аРС = АЧТВ с добавлением аРС / АЧТВ без добавления аРС. 

При резистентности к аРС это отношение составляет менее 2. Результат зависит от реагентов и оборудования, а также от активности в исследуемом образце плазменных факторов, присутствия их ингибиторов или гепарина*. Значительно снизить зависимость результата теста от прочих факторов исследуемой плазмы позволяет определение аРС-резистентности с разведением исследуемого образца субстратной плазмой, дефицитной по фактору V, в соотношении 1:5. Метод имеет высокие специфичность и чувствительность; на его результаты может влиять лишь присутствие волчаночного антикоагулянта в высоком титре.

Более надежные результаты дает вариант теста aPCR с расчетом нормализованного отношения. В дефицитную по фактору V субстратную плазму добавляют активатор протеина С и инкубируют при 37 °С; параллельно проводят инкубацию такой же плазмы без активатора. Далее в обе пробы добавляют исследуемую плазму и с помощью коагулометра или мануальным методом (в водяной бане) определяют активированного частичного тромбопластинового времени смесей; результаты обозначают как активированное частичное тромбопластиновое время иссл. акт. и активированного частичного тромбопластинового времени иссл. Аналогично проводят определение с добавлением стандартной контрольной плазмы, заменяя ею исследуемую плазму; результаты обозначают как активированное частичное тромбопластиновое время станд. акт. и активированное частичное тромбопластиновое время станд. Резистентность к активированному протеину С определяется нормализованным отношением которое рассчитывают по формуле:

НО = k х (АЧТВ иссл. акт. х АЧТВ станд.) / (АЧТВ станд. акт. х АЧТВ иссл.),

где k — коэффициент, равный значению НО - нормализованное отношениедля стандартной контрольной плазмы (указывается в паспорте набора).

Возможно проведение исследования по аналогичной схеме с использованием препарата яда гадюки Рассела; есть данные, что при этом существенно повышаются специфичность и положительная предсказательная ценность теста.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют: аРС-отношение — более 2; НО — более 0,8 (0,8-1,5).

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ, ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Те же, что в клоттинговом тесте протеина С. На результаты определения влияет гепарин.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Значение аРС-отношения более 2 или нормализованное отношение ниже 0,8 свидетельствуют о резистентности фактора V к активированному протеину С. Основные причины ее развития — наличие мутантного фактора V (подтверждение — на основе генетического тестирования с обнаружением мутации гена FV, наиболее частая из них — мутация Лейден, G1691A), а также присутствие волчаночного антикоагулянта и увеличение активности фактора VIII. Снижение НО возможно при беременности, приеме эстрогенов, оральных контрацептивов.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Приобретенная и врожденная резистентность к активированному протеину С сопровождается тромбофилией. Женщинам с aPCR противопоказан прием эстрогенных препаратов и оральных контрацептивов, а при планировании и ведении беременности необходима антитромботическая профилактика.

Протеин S(количество/активность)
Протеин S (npS) — витамин К-зависимый неферментный кофактор протеина С — синтезируется в печени и циркулирует в кровотоке. Около 60% в плазме связано с С4b-переносящим белком, около 40% составляет свободная активная форма. При отсутствии или недостаточной концентрации активность протеина С существенно снижается, что ведет к нарушению функции антикоагулянтного звена.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА, АНАЛИТИЧЕСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
В клоттинговом тесте к дефицитной по протеину S субстратной плазме добав-ляют разведенную исследуемую плазму, фосфолипиды, активный протеин С и его субстрат — фактор Va. В ходе инкубации часть фактора Va расщепляется протеином С, причем скорость распада зависит от содержания в исследуемой плазме протеина S. Оставшееся количество фактора Va при добавлении Са2+ способствует активации фактора X, что приводит к образованию тромбина и формированию сгустка. Степень увеличения активированного частичного тромбопластинового времени смеси определяется количеством свободного протеина S в исследуемой плазме: чем больше его содержание, тем более значительно увеличение активированного частичного тромбопластинового времени. Наряду с плазмой пациента исследуют нормальную референтную пулированную плазму; результат выражается в процентах показателя плазмы. Иммунохимигескими методами определяют количество протеина S, но не его функциональную активность. Прямое определение общего ITpS (свободного и связанного) основано на использовании поликлональных антител, свободного npS — моноклональных антител, высокоспецифичных к эпитопам свободной формы анализа.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Те же, что в тесте протеина С.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Общий протеин S — 65-140% уровня РНП-плазмы, или 0,67-1,25 ЕД/мл; сво-бодный протеин S — 57-120%, или 0,23-0,49 ЕД/мл.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты ИФА-теста влияют липемия и присутствие ревматоидного фактора. Снижение уровня ПрБ может быть связано с приемом пероральных контрацептивов. Для нейтрализации гепарина в концентрации до 1,2 ЕД/мл в клоттинговом тесте в состав буферного раствора вводят синтетический антагонист гепарина — полибрен.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Для контроля качества используют стандартную контрольную плазму.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Снижение активности (концентрации) протеина S возможно при остром воспалении и во время беременности (связывание с острофазным С4Ь-связывающим белком), а также при тяжелых поражениях печени, гиповитаминозе К, при лечении варфарином (нарушение синтеза). Существенное снижение количества чаще свидетельствует о врожденной недостаточности; аномалии структуры, функциональная неполноценность наблюдаются редко. При нефротическом синдроме снижается соотношение свободной и связанной форм npS из-за потерь свободной формы через почки.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Выявление снижения содержания/активности протеина S важно для определения причин тромбофилии с эпизодами венозного тромбоза и тромбоэмболии как в молодом, так и зрелом возрасте. Дефицит протеина S может влиять на тактику ведения больных с тромбозами и использования гормональных препаратов у женщин. 

ХIIа-калликреинзависимый фибринолиз
Активация фибринолиза протекает одновременно с запуском внутреннего пути гемостаза, поскольку инициируется одними и теми же факторами — фактором XII и компонентами калликреинкининовой системы; фактор XII даже более значим для фибринолиза, чем для гемостатических функций. Образующийся активный плазмин постепенно разрушает фибриновые сгустки и способствует восстановлению кровотока в сосуде.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Из бедной тромбоцитами цитратной плазмы в слабокислой среде после добавления каолина выделяют эуглобулиновую фракцию, содержащую фибриноген, плазминоген и активированные факторы внутреннего пути свертывания (в том числе фактор XII, калликреин и плазмин). После отделения зуглобулинов, их растворения в буферном растворе и рекальцификации образуется фибриновый сгусток, который растворяется плазмином (определяют время лизиса сгустка). Благодаря быстрому выполнению методика выгодно отличается от теста спонтанного лизиса зуглобулинов, в котором их осаждение проводят при охлаждении, каолин к плазме не добавляют и контактные факторы гемостаза дополнительно не активируются. Метод можно применять для оценки активации фибринолиза in vivo при стимуляции выброса тканевого активатора плазминогена из эндотелия в кровь. Для этого определяют время лизиса зуглобулинов в плазме крови, полученной из вены до и после дозированного венозного стаза, создаваемого с помощью сфигмоманометра.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения бедной тромбоцитами цитратной плазмы. Плазма для исследования должна быть получена не более чем за 2 ч до анализа. Не допускается анализ плазмы, имеющей сгустки, следы гемолиза, а также замороженной и оттаянной.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Разведенную водой исследуемую плазму подкисляют уксусной кислотой, добавляют суспензию каолина, инкубируют при 37 °С, центрифугируют и удаляют супернатант. Оставшийся на дне пробирки осадок зуглобулинов разводят в буфере, добавляют раствор Са Сl2 (при этом образуется сгусток) и инкубируют, определяя время от момента образования до полного растворения сгустка.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
ХIIа-зависимый лизис зуглобулинов — 4-12 мин. В тесте стимуляции выброса тканевого активатора плазминогена время лизиса зуглобулинов после венозного стаза уменьшается в норме в 1,5-2 раза.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты исследования существенно влияют концентрация фибриногена в исследуемой плазме, введение лекарственных препаратов, стимулирующих протеолитические процессы (фибринолитиков), а также ингибиторов протеолиза (контрикала, трасилола и др.)

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Четкая процедура контроля в настоящее время не определена. Проверку качества реактивов и методики проводят путем исследования свежеразведенной стандартной контрольной плазмы или свежей пулированной плазмы от здоровых людей.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Замедление ХIIа-зависимого лизиса зуглобулинов (увеличение времени фибринолиза) наблюдается вследствие снижения уровня или недостаточной активации участвующих в реакции компонентов (фактора XII, прекалликреина, высокомолекулярного кининогена, плазминогена). Чаще всего удлинение времени лизиса до 30-60 мин и более связано с дефицитом плазминогена, присутствием большого количества ингибиторов протеолиза либо с гиперфибриногенемией (образуется более плотный и медленнее лизируемый сгусток). В систему можно дополнительно ввести стрептокиназу или урокиназу, которые при нарушении активации плазмина нормализуют лизис сгустка, а при дефиците плазминогена — существенно не влияют на фибринолиз. При дисфункции эндотелия (тромбозах, патологии почек и прочих состояниях) выход тканевого активатора плазминогена в кровь нарушается, и время лизиса зуглобулинов после венозного стаза остается удлиненным или уменьшается менее чем в 1,5 раза.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование лизиса зуглобулинов проводят для оценки состояния системы фибринолиза у пациентов. Метод чувствителен к любой патологии плазменных протеолитических систем, в частности при тромбозах, болезнях печени, иммунных и иммунокомплексных заболеваниях и др., а также при передозировке лекарственных препаратов — ингибиторов протеаз.

Плазминоген (количество/максимальная активность)
Плазминоген — главный компонент фибринолитической системы — синтезируется в печени и почках и постоянно находится в крови. Образующийся из плаз-миногена под действием активаторов плазмин разрушает фибриновые сгустки и способствует восстановлению кровотока.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
После максимальной активации стрептокиназой плазминогена в исследуемой плазме определяют скорость расщепления пептидного хромогенного субстрата (по нарастанию окраски реакционной среды, метод фиксированного времени). Количество образуемого при этом окрашенного вещества прямо пропорционально количеству активности плазминогена. Для определения количества плазминогена можно использовать и метод иммуноферментного анализа.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Те же, что в тесте лизиса зуглобулинов.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение проводят на фотометре, биохимическом анализаторе или анализаторе гемостаза с фотометрическим каналом. Исследуемую бестромбоцитарную плазму разводят буферным раствором, добавляют стрептокиназу и инкубируют при 37 °С. Затем в реакционную смесь вводят хромогенный субстрат и по истечении определенного времени останавливают реакцию добавлением уксусной кислоты. Свежеразведенную стандартную нормальную плазму с известным количеством плазминогена, входящую в набор, обрабатывают по такой же процедуре, пробу-бланк — так же, как стандартную, но без добавления стрептокиназы. После остановки реакции определяют оптическую плотность исследуемого и стандартного образцов против бланка при А=405 нм и вычисляют количество плазминогена (активность плазмина) в исследуемом образце в процентах стандартной плазмы.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Составляют 75-135% уровня стандартной плазмы; при определении ИФА-методом — около 200 мкг/мл.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На результаты исследования влияют лекарственные препараты — ингибиторы протеолиза (контрикал, трасилол и др.). Прием эстрогенсодержащих препаратов, стимулирующих синтез белков (в том числе плазминогена) в печени, также может отразиться на результатах теста.

ОБЕСПЕЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Проверку качества реактивов и методики проводят путем исследования свежеразведенной лиофилизированной контрольной плазмы.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Абсолютное снижение уровня плазминогена почти всегда связано с его гиперпотреблением в результате активации фибринолиза, сопровождающей диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови, массивные и/или длительные тромбозы, тромбоэмболии, инфаркт миокарда и др., а также процедуру тромболизиса. Врожденное снижение концентрации плазминогена часто сочетается с его функциональной неполноценностью и является тромбофилическим состоянием. Гипоплазминогенемия может также развиваться при хронической тяжелой патологии печени и почек; в то же время к концу беременности, при инфекциях, воспалительных процессах, опухолях, травмах концентрация/активность плазминогена может нарастать.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест используют для оценки состояния фибринолиза и резерва плазминогена у пациентов. Лечение активаторами плазминогена (стрептокиназой, урокиназой, алтеплазой и др.) может быть эффективным только при его достаточном уровне в крови; для экстренного восполнения плазминогена можно ввести свежезамороженную плазму.

Тканевый активатор плазминогена
Тканевый активатор плазминогена — важный ферментный фактор фибринолитической системы, основной активатор плазминогена на поверхности фибри-нового сгустка. Тканевый активатор плазминогена синтезируется и секретируется клетками эндотелия. Время его полужизни в кровотоке — около 5 мин (захватывается клетками печени), в плазме крови — дольше. Потеря активности тканевого активатора плазминогена происходит при связывании с избытком ингибитора активатора плазминогена, также секретируемым эндотелиальными клетками; в кровотоке в основном обнаруживают стабильные неактивные комплексы. Уровень тканевого активатора плазминогена увеличивается с возрастом, после физических нагрузок и стрессов.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Хромогенный метод основан на определении степени активации стандартного количества плазминогена тканевым активатором, содержащимся в исследуемой разведенной плазме. В дальнейшем плазмин расщепляет хромогенный субстрат с образованием окраски, интенсивность которой измеряется на фотометре или био-химическом анализаторе методом фиксированного времени. 

Иммуноферментный метод с моноклональными антителами позволяет определять количество как свободной, так и связанной формы тканевого активатора плазминогена (антигена). В состав набора входит плазма-калибратор, уровень тканевого активатора плазминогена в которой соотнесен с международным стандартом.

Комбинированный метод, сочетающий классический твердофазный иммуноферментный анализ с хромогенным методом, позволяет определять активность и количество тканевого активатора плазминогена. Комбинированный метод основан на использовании антител, не влияющих на функциональную активность тканевого активатора плазминогена и иммобилизованных в лунках микропланшета. Их используют для связывания тканевого активатора плазминогена, содержащегося в плазме, с поверхностью лунок. После первой инкубации несвязавшиеся компоненты плазмы удаляются промывкой. Затем в лунки добавляют субстратный раствор для определения активности, содержащий Glu-плазминоген, CNBr-фрагменты фибриногена и хромогенный субстрат плазмина. Связавшийся тканевый активатор плазминогена активирует Glu-плазминоген с образованием плазмина. В результате реакции между плазмином и хромогенным субстратом плазмина образуется окрашенный продукт. Интенсивность развившегося окрашивания, пропорциональную количеству активного тканевого активатора плазминогена в исследуемом образце, измеряют фотометрически. После измерения раствор для определения активности удаляют промывкой и в лунки добавляют конъюгат моноклональных антиЧРА-антител, распознающих обе формы тканевого активатора плазминогена — активную и связанную с пероксидазой хрена. По окончании инкубации антителами и промывки в лунки добавляют субстрат, в результате чего образуется окрашенный продукт. Интенсивность окрашивания пропорциональна общей концентрации тканевого активатора плазминогена в тестируемом образце, на этой стадии определяется как свободная форма тканевого активатора плазминогена, так и комплекс.

О способности тканевого активатора плазминогена высвобождаться из клеток сосудистой стенки при дозированном венозном стазе свидетельствует результат манжеточной пробы: на плечо накладывают манжету тонометра, раздувают ее до 40 мм Hg и держат 10-15 мин; до и после процедуры берут кровь и определяют в плазме уровень тканевого активатора плазминогена или скорость фибринолиза.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
Можно использовать цитратную или ЭДТА-плазму, полученную у пациента утром натощак; исследование должно быть проведено не позднее 8 ч с момента взятия крови или 4 ч после размораживания. Тканевый активатор плазминогена неустойчив, для предупреждения его быстрого ингибирования in vitro пробы крови подкисляют (выпускаются пробирки с кислым антикоагулянтом). На результаты иммуноферментного анализа не влияют гепарин в концентрации до 2 МЕ/мл и ИАП-1 — до 100 нг/мл.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Более 10 нг/мл. При стимуляции уровень тканевого активатора плазминогена возрастает до 15 нг/мл.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Возрастание концентрации тканевого активатора плазминогена наблюдается при остром инфаркте миокарда, инсульте, заболеваниях печени, сепсисе и др. Быстрое увеличение концентрации тканевого активатора плазминогена как за счет выброса из клеточных депо, так и за счет ускорения синтеза вызывается венозной окклюзией, физической нагрузкой, введением десмопрессина, катехоламинов и может повышать фибринолитическую активность. Вместе с тем при медленном нарастании плазменной концентрации повышенный уровень тканевого активатора плазминогена (антигена) часто сочетается с высоким уровнем ИАП-1, что сопровождается снижением фибринолитического потенциала плазмы.

Уровень тканевого активатора плазминогена бывает снижен у пациентов с тромботическими нарушениями (тромбозом глубоких вен, инфарктом миокарда, ишемическим инсультом), злокачественными новообразованиями и тяжелым сепсисом. Снижение тканевого активатора плазминогена часто ведет к недостаточности фибринолиза и является фактором риска развития тромбозов. Определение тканевого активатора плазминогена проводят для выявления причины тромбофилии у больных, а также в ходе терапии активаторами фибринолиза (алтеплазой и др.) Выявлена прямая связь между уровнем тканевого активатора плазминогена (антигена) и степенью риска развития и прогрессирования сердечно-сосудистой патологии; повышение тканевого активатора плазминогена после инфаркта миокарда рассматривается как маркер дисфункции эндотелия и неблагоприятный прогностический фактор. Нарушение высвобождения tPA из сосудистого эндотелия после венозного стаза описано у больных с тромбозами и патологией почек.

Повышенные уровни tPA-антигена и активности тканевого активатора плазминогена. Такие результаты свидетельствуют об увеличении выброса тканевого активатора плазминогена, который не сбалансирован соответствующим усилением выброса PAI-1. Это указывает на пер-вичный гиперфибринолиз и, вероятно, приведет к образованию плазмина, расходу ингибиторов плазмина и деградации других белков плазмы, таких как фибриноген и фактор VIII.

Повышенный уровень tPA-антигена и нормальная активность тканевого активатора плазминогена. Такой результат отражает длительное накопление тканевого активатора плазминогена из-за снижения его деградации в печени. Это может наблюдаться при различных заболеваниях печени. Если повышение уровня антигена нейтрализуется одновременным повышением уровня ингибитора PAI-1, заметным остается только повышение уровня антигена тканевого активатора плазминогена. Кроме того, к значительному повышению уровня tPA-антигена при низкой или слабоповышенной активности тканевого активатора плазминогена может приводить гепариновая терапия.

Сниженные tPA-антиген и tPA-активность. Такой результат может быть безошибочно получен только при тестировании образцов плазмы при венозной окклюзии. Такие образцы плазмы должны показывать повышение как активности, так и антигена. Если и активность, и антиген понижены в таких образцах, это свидетельствует о неспособности организма пациента адекватно реагировать на данный тип стимуляции. Приблизительно 10% всех пациентов, страдающих тромбозом, попадают в эту группу.

Сниженная tPA-активность при нормальном уровне tPA-антигена. Аналогично предыдущему случаю такой результат может наблюдаться только при тестировании образцов плазмы с ожидаемыми высокими значениями tPA- активности и tPA-антигена, например при венозной окклюзии. У таких пациентов происходит нормальная секреция tPA-антигена в ответ на венозную окклюзию или иную стимуляцию. Однако слишком высокий уровень PAI-1 нейтрализует увеличившуюся активность тканевого активатора плазминогена, в результате чего наблюдается высокий уровень комплекса. Приблизительно 20% пациентов с тромбофилией попадают в эту группу.

Ингибитор активатора плазминоген
Ингибитор активатора плазминогена — основной фактор, связывающий и ингибирующий как тканевый, так и урокиназный активаторы плазминогена, — секретируется эндотелиальными клетками. Ингибитор активатора плазминогена также может высвобождаться из тромбоцитов. Синтез ингибитора активатора плазминогена значительно усиливается при повреждении эндотелия, что приводит к замене антикоагулянтного потенциала эндотелия на прокоагулянтный.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Двухэтапный хромогенный метод определения ингибитора активатора плазминогена основан на добавлении к исследуемой плазме стандартного количества тканевого активатора; при этом активность последнего частично подавляется присутствующим в плазме пациента ингибитора активатора плазминогена. Оставшаяся активной часть тканевого активатора активируется добавленным в избытке плазминогеном; образовавшийся плазмин гидролизуется хромогенным субстратом с образованием окраски (ее интенсивность обратно пропорциональна содержанию ингибитора активатора плазминогена). Параллельно проводят исследование стандартной контрольной плазмы.

Иммунохимигескими тестами можно определить как общую концентрацию антигена ингибитора активатора плазминогена (классическим ИФА-методом), так и активную (свободную) форму ингибитора активатора плазминогена по ее способности связываться с молекулами тканевого антигена, иммобилизированными в лунке планшета, и с конъюгатом пероксидазы с моноклональными антителами к ингибитору активатора плазминогена. Тесты специфичны, на их результаты не влияют другие ингибиторы.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ
Ингибитор активатора плазминогена неустойчив, поэтому анализ необходимо проводить в кратчайшие сроки после взятия крови, лучше с использованием CTAD-пробирок (с добавлением стабилизаторов для гемостаза). Особое внимание уделяют режиму получения цитратной бестромбоцитной плазмы, поскольку ингибитор активатора плазминогена может дополнительно высвобождаться из тромбоцитов. Плазму переносят в пластиковые пробирки и хранят на льду до исследования. Уровень ингибитора активатора плазминогена в утренней пробе крови вдвое превышает его концентрацию в крови, взятой днем.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Общий ИАП-1 — 2-40 нг/мл (рост уровня с возрастом), свободный (актив¬ный) - 1-7 ЕД/мл.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ, ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Ингибитор активатора плазминогена - белок острой фазы, его концентрация в плазме возрастает вместе с интерлейкином-1. Повышенный уровень ингибитора активатора плазминогена отмечается после травм и операций, при венозных тромбозах, воспалении, инфекционных процессах и сепсисе, злокачественных опухолях, ожирении, болезнях печени, инфаркте миокарда и коронарных заболеваниях, синдроме привычного невынашивания беременности, а также при лечении глюкокортикоидами. Некоторое повышение ингибитора активатора плазминогена (одновременно с тканевый антигеном) возможно при нормальной беременности. Уровень общего ингибитора активатора плазминогена1 более 100 нг/мл и активность свободного ингибитора активатора плазминогена выше 20 ЕД/мл могут указывать на снижение фибринолитической активности и повышенный риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и тромботических осложнений. Прогрессирующий подъем ингибитора активатора плазминогена при остром инфаркте миокарда является неблагоприятным прогностическим признаком и свидетельствует о дисфункции эндотелия.

D-димер
D-димер — продукт распада фибринового сгустка — представляет собой моле-кулярные фрагменты поперечно сшитого фибрина, образуемые при его про- теолитической деградации активным плазмином. В структуре D-димера имеются D-D-связи (поперечные сшивки), которые отсутствуют в фибриногене, фибринмономере и рыхлом фибринполимере. D-D-связи образуются в результате действия фактора XIIIa, уплотняют фибриновый сгусток и не разрушаются плазмином.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. На определение D-димера мало влияют погрешности техники взятия крови и примесь тромбоцитов. Не рекомендуют исследовать плазму, в которой образовались сгустки in vitro. Возможно определение D-димера в сыворотке, но только при условии полного свертывания крови и предотвращения фибринолиза во взятом образце (что достаточно трудно обеспечить). При получении сыворотки, во избежание новообразования D-димера in vitro, сгусток необходимо быстро извлечь; к пробе крови можно предварительно добавить ингибитор фибринолиза (е-аминокапроновую кислоту).

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение D-димера в плазме или сыворотке проводят методами латекс-агглютинации, иммунохроматографии (мембранной иммунодиффузии), иммунотурбидиметрии с усилением пластиковыми частицами, иммунохемилюминесценции; в цельной крови — исследованием агглютинации эритроцитов пациента в присутствии биспецифичных антител к D-димеру и поверхностному белку эритроцитарных мембран. Для полуколичественной оценки в тесте латекс-агглютинации определяют наибольшее разведение плазмы или сыворотки, дающее видимую агглютинацию латексных частиц с фиксированными на них моноклональными антителами к D-димеру. В иммунохроматографическом полуколичественном тесте при связывании D-димера с конъюгатом антитело-золото интенсивность окрашивания тестовой зоны на картридже сравнивают со специальной цветовой шкалой.

Для точной количественной оценки результатов используют рефлектометрические приборы, позволяющие определить содержание D-димера с точностью до 0,1 мг/л в интервале от 0,1 до 20,0 мг/л. Используют также иммуноферментный метод с латексным усилением, обладающий высокими аналитическими характеристиками. В целом для анализа D-димера предпочтительнее количественные методы, позволяющие вести временной мониторинг анализа. Результаты характеризуются достаточно высокой специфичностью благодаря использованию иммунных методов. ИФА-метод характеризуется более высокой чувствительностью по сравнению с турбидиметрией и иммунохроматографией, поэтому этот метод оптимален для мониторинга уровня D-димера, за исключением случаев неотложных состояний. Описана возможность искажения результатов полуколичественного теста при ревматоидном факторе.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
В количественных тестах — 110-300 нг/мл, или менее 0,5 мг/л; в качественных тестах D-димер у здоровых людей не выявляется (ниже минимального уровня).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Значительное повышение D-димера наблюдается при диссеминированноv внутрисосудистоv свертываниb крови (начиная с ранних стадий), тромбоэмболии легочной артерии, артериальных и венозных тромбозах, а также после травм и хирургических операций (особенно на крупных костях и суставах). Уровень D-димера бывает повышен при инфаркте миокарда, тромболитической терапии, некоторых инфекционных заболеваниях и злокачественных новообразованиях. Возможен некоторый рост уровня D-димера при беременности, сахарном диабете, длительной иммобилизации, в пожилом возрасте и т. д. D-димер является достаточно инерционным показателем ввиду отно¬сительно длительной циркуляции в кровотоке (период полувыведения — более 24 ч).

Чувствительность теста в диагностике венозного тромбоэмболизма очень высока — 90-97%, специфичность же невелика (60-70%). Таким образом, отрицательный результат анализа или значение ниже точки cut-off практически всегда свидетельствует об отсутствии тромбов в кровеносном русле. Ложноотрицательные результаты редки (при очень малом размере тромба, угнетении фибринолиза и/или резком дефиците плазмина). При оценке результатов исследования, особенно количественного, нужно учитывать, что повышение уровня D-димера указывает на образование фибрина и его лизис плазмином, а в каком отделе сосудистого русла, в каком объеме и по какой причине это произошло — необходимо решать в каждом конкретном случае.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Основная цель исследования D-димера — исключение наличия тромбов в сосудистом русле (при дифференциальной диагностике тромбоза глубоких вен нижних конечностей, тромбоэмболии легочной артерии и др.). Его можно применять как тест первой линии, т. е. у всех больных с подозрением на венозный тромбоэмболизм, с последующим проведением дополнительных исследований у пациентов с положительными результатами теста на D-димер. Другой стратегический подход — предварительная оценка по балльным шкалам. При высокой клинической вероятности тромбоза или эмболии измерение D-димера не проводят, а сразу выполняют дополнительные диагностические процедуры и начинают активную антикоагулянтную терапию; при средней или низкой вероятности диагноза измеряют уровень D-димера и в зависимости от полученного результата принимают решение о дальнейших действиях. Тест можно использовать в диагностике диссеминированного внутрисосудистого свертывания и при определении эффективности антитромботической терапии. При отсутствии срочности (не в ургентной ситуации) значение имеет только количественное определение D-димера.

Растворимые фибрин-мономерные комплексы
Образование фибрин-мономеров — начальная реакция формирования сгустка; количество фибринолиза зависит от степени тромбинемии. В процессе физиоло-гической активации фибринолиза продукты деградации фибрина и фибриногена образуют комплексы с фибрин-мономерами, в результате формируются растворимые фибрин-мономерные комплексы.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
РФМК-тест — паракоагуляционная проба, позволяющая оценить содержание в плазме крови растворимых фибрин-мономерных комплексов, способных преципитироваться в присутствии некоторых химических агентов. В зависимости от активатора преципитации обозначают конкретный метод выявления РФМК. В частности, о-фенантролиновый метод основан на регистрации времени появления хлопьев или зерен паракоагулята при добавлении к исследуемой плазме раствора о-фенантролина, при этом скорость образования хлопьев зависит от концентрации растворимых фибрин-мономерных комплексов. В стеклянной пробирке при комнатной температуре и непрерывном покачивании смешивают исследуемую плазму с раствором о-фенантролина; на черном фоне в проходящем свете визуально определяют время появления хлопьев паракоагулята. Полуколичественную оценку проводят сопоставлением времени (если оно менее 120 с) с концентрацией растворимых фибрин-мономерных комплексов по специальной таблице; чем меньше время, тем выше содержание фибрин-мономерных комплексов. Оценка результатов субъективна, и в целом точность метода невысока.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. Ложноположительные результаты возможны при попадании в пробирку первых капель, содержащих фрагменты тканей, и недостаточно быстром перемешивании с антикоагулянтом. Не допускается анализ плазмы, имеющей сгустки и полученной более чем за 2-4 ч до анализа. Возможно искажение результатов при парапротеинемии, инфузии некоторых белковых препаратов и кровезаменителей. Завышенные значения могут быть у беременных и новорожденных.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Хлопья не должны образовываться в первые 70-120 с наблюдения (отрицательный результат пробы, концентрация растворимых фибрин-мономерных комплексов — <35-40 мг/л).

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Положительный результат является признаком тромбинемии и наблюдается при активации свертывания, тромбофилических состояниях (в том числе при злокачественных новообразованиях), а также при тромбозах, эмболиях и диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови. По результатам РФМК-теста судят об активности свертывания крови, а по динамической оценке уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов — о развитии процесса и эффективности терапевтических мероприятий. Однако ввиду невысокой чувствительности, отсутствия калибровочных и контрольных материалов и субъективности оценки результатов РФМК-тест можно рассматривать только как ориентировочный. Применение паракоагуляционных тестов нецелесообразно при доступности современных стандартизированных методик оценки активации свертывания и фибринолиза.

Волчаночный антикоагулянт
Волчаночный антикоагулянт — гетерогенная группа антител против отри-цательно заряженных анионных фосфолипидов и их комплексов со специфическими белками. Антикоагулянты волчаночного типа связываются с фосфолипидными мембранами и «экранируют» их, при этом тормозится активация коагуляционных ферментных комплексов и замедляется свертывание крови in vitro. Вследствие повреждения антителами мембран эндотелиальных клеток, снижения продукции простациклина и нарушений в антикоагулянтной системе протеина С у пациентов возникает тромбофилическое состояние, чреватое развитием тромбозов (тромбоэмболий) и ишемическим поражением тканей.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
Присутствие волчаночного антикоаглянта приводит к удлинению времени образования сгустка в фосфолипидзависимых коагуляционных тестах, наиболее отчетливо — при низких концентрациях активаторов свертывания. Обусловленная волчаночного антикоаглянта гипокоагуляция не корригируется нормальной бедной тромбоцитами плазмой, но исправляется добавлением к исследуемой плазме тканевых или эритроцитарных фосфолипидов или разрушенных тромбоцитов.

Дополнительным признаком наличия волчаночного антикоаглянта в тесте с препаратами змеиных ядов может служить возрастание текстарин-экаринового (или лебетокс-эхитоксового) коэффициента. Его значимость обусловлена тем, что действие текстарина или лебетокса (прямого активатора фактора X) зависит от присутствия фосфолипидов и наличия волчаночного антикоаглянта, а экарина или эхитокса (прямого активатора протромбина) — не зависит.

ПРЕАНАЛИТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ
Соблюдают общие условия взятия венозной крови для исследования гемостаза и получения цитратной плазмы. Наличие тромбоцитов в пробе, превышающее 10х109/л, может маскировать вызванные волчаночным антикоаглянтом коагуляционные сдвиги и дать лож-ноотрицательный результат, поэтому особое внимание уделяют режиму получения бестромбоцитной плазмы (необходимо двухэтапное центрифугирование).

Определение волчаночного антикоаглянта основано на клоттинговых тестах, результаты которых зависят от использования антикоагулянтов — гепарина4 и антагонистов витамина К. Во избежание ложноположительных результатов определения волчаночного антикоаглянта пациенту необходимо отменить гепарин минимум за 2 дня, кумариновые препараты (варфарин) — за 2 нед до взятия крови. Однако реальная клиническая ситуация (тромбозы, тромбоэмболии) не всегда позволяет отменить препараты перед лабораторным исследованием; в первую очередь, это относится к гепарину.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Определение волчаночного антикоаглянта проводят в соответствии с рекомендациями Международного общества по изучению тромбозов и гемостаза (ISTH — исследовательская группа по В А и фосфолипидзависимым антителам); критерии диагностики были приняты в 1999 г. в Саппоро и обновлены в 2004 г. в Сиднее. Учитывая, что тест на волчаночный антикоаглянт со 100% чувствительностью отсутствует, на I этапе (скрининговые исследования) проводят минимум два теста с исследуемой и контрольной плазмой.

Чаще используют тесты, основанные на активированное частичное тромбопластиновое время с низким содержанием фосфолипидов (более чувствителен к АЧТВ-реагенту на основе каолина или кремнезема), а также dRVVT. Увеличение времени свертывания по сравнению с контрольной плазмой более чем в 1,2-1,25 раза может быть связано с наличием в исследуе¬мом образце; дальнейшему исследованию подвергают только такие пробы.

На II этапе (подтверждающие исследования) проводят последовательно два микс-теста на основе того типа исследования, которое было положительным на I этапе:
• микс-тест с нормальной плазмой. Повторяют то исследование, которое было проведено на I этапе, взяв вместо исследуемой плазмы ее смесь в соотношении 1:1 с нормальной бедной тромбоцитами плазмой, прогретую при 37 °С в течение 1-2 ч. Если в исследуемой плазме присутствуют ингибиторы коагуляции, добавление нормальной плазмы не нормализует время свертывания — оно остается удлиненным более чем в 1,2 раза по сравнению с нормальной донорской плазмой. Такие пробы подвергают исследованию на следующей стадии;
• микс-тест с фосфолипидами. Повторяют исследование предыдущей стадии, взяв смесь в соотношении 1:1 исследуемой плазмы с препаратом компенсирующих фосфолипидов (тромбоцитином, эритрофосфатидом и т.д.); аналогично обрабатывают контрольную плазму. Если в исходно нарушенных коагуляционных тестах происходит полная или выраженная нормализация времени свертывания (оно становится близким к результату, полученному на смеси контрольной плазмы с фосфолипидами), результат подтверждающих проб на волчаночный коагулянт считают положительным. 

Таким образом, заключение о наличии волчаночного коагулянта в исследуемой плазме, согласно руководству ISTH, делают на основании удлинения свертывания плазмы в фосфолипидзависимых коагуляционных тестах.
• Активированное частичное тромбопластиновое времяс люпус-чувствительным реагентом. Соотношение активированного частичного тромбопластинового времени больного/ активированное частичное тромбопластиновое время донора - более 1,2 (например, 40/30=1,33).
• dRVVT — тест с разведенным ядом гадюки Рассела. Соотношение dRVVT больного/dRVVT донора — более 1,2.
• Отсутствие коррекции удлиненного активированного частичного тромбопластинового времени в микс-тесте с донорской плазмой 1:1.
• Укорочение или коррекция активированного частичного тромбопластинового времени и dRVVT в подтверждающих тестах при добавлении фосфолипидов (гексагональных фосфолипидов, лиофилизиро- ванных тромбоцитов, экстракта мозга кролика и др.)

РЕФЕРЕНТНЫЕ ПРЕДЕЛЫ
Диагностический тест на волчаночный коагулянт дает положительные результаты только при патологии. Степень коррекции, т. е. соотношение времени свертывания без добавления фосфолипидов и после их внесения, свидетельствующее о наличии волчаночного коагулянта, остается предметом обсуждения; в любом случае следует придерживаться рекомендаций производителя используемых реагентов.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
На определение волчаночного коагулянта могут влиять многие факторы. Удлинение времени свертывания на I этапе может быть связано с наличием гепарина в пробе; для проверки его присутствия можно определить волчаночного коагулянта исследуемой плазмы исходно и после обработки сорбентом гепарина или гепариназой. Определение волчаночного коагулянта в период гепаринотерапии проводить нельзя.

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Если результаты скрининговых тестов не противоречат предположению о наличии волчаночного коагулянта, микс-пробы с нормальной плазмой не дали коррекции, но после добавления фосфолипидов произошла коррекция времени свертывания, то в плазме крови присутствует волчаночный коагулянт. Однако это не означает наличие у больного антифосфолипидного синдрома, так как волчаночный коагулянт может транзиторно появляться при вирусных заболеваниях, после вакцинации и приема некоторых лекарственных препаратов.

Наличие в плазме волчаночного ковгулянта на фоне аутоиммунной патологии (системной красной волчанки, ревматоидного артрита и др.) рассматривается как тромбофилическое состояние. При этом увеличивается риск рецидивирующих тромбозов вен и артерий, нарушений мозгового кровообращения, фетоплацентарной недостаточности и привычного невынашивания беременности (выкидышей, внутриутробной гибели плода), наблюдается наклонность к тромбоцитопении, развитию диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови, реже - к полиаллергии и другим иммунным нарушениям.

Антитела к фосфолипидам
Антифосфолипидные антитела представляют собой гетерогенную группу аутоантител, взаимодействующих с анионными и нейтральными фосфолипидами, с комплексами фосфолипидов и фосфолипидсвязывающих специфических белков плазмы крови, а также с гликопротеиновыми рецепторами клеток крови, ассоциированными с фосфолипидами. Антифосфолипидные антитела реагируют не собственно с фосфолипидами, а со связывающими их белками, поэтому правильнее считать антифосфолипидные антитела антителами к белково-фосфолипидным комплексам.

Указанные антитела классов IgG и IgM можно обнаружить как при первичном, так и при вторичном антифосфолипидном синдроме, сопровождающемся рядом воспалительных и невоспалительных заболеваний. В отличие от волчаночного антикоагулянта, они редко приводят к удлинению клоттинговых тестов (за исключением антител к р2-гликопротеину-1, часто ассоциированных с гипокоагуляционными сдвигами); наличие антифосфолипидного антитела связывают с риском развития тромбозов и других осложнений. Содержание антител указанных типов может быть умеренно повышено у некоторых здоровых людей, а также после перенесенных вирусных или бактериальных инфекций или приема некоторых лекарственных препаратов. В таких случаях необходимы сопоставление результатов с клинической картиной и повторное исследование с интервалом не менее 9-12 нед. В соответствии с критериями ISTH определение антифосфолипидных антител следует проводить методом иммуноферментного анализа с выявлением кардиолипинсвязанного р2-гликопротеина-1 и прямым определением антител к анти-р2-гликопротеину-1.

РЕФЕРЕНТНЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Зависят от диагностического набора и указываются фирмой-производителем. Так, для антител к КЛ IgG — менее 10—19 МЕ/мл, IgM — менее 10 МЕ/мл, IgA — менее 15 МЕ/мл.

ИНТЕРФЕРЕНЦИИ
В ряде ситуаций ИФА-определению антител к фосфолипидам и специфическим белкам мешают ревматоидный, антинуклеарный факторы, криоглобулины; при их высокой концентрации в крови для диагностики антифосфолипидного антитела проводят определение волчаночного антикоагулянта.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Антифосфолипидный синдром диагностируют лишь при постоянном наличии антифосфолипидных антител в крови пациента. Уровень стандартизации лабораторных исследований в этом направлении пока недостаточен, а риск гипер-диагностики относительно велик, поскольку у 1-5% людей в общей популяции определение антифосфолипидное антитело дает положительный результат. Лабораторными критериями антифосфолипидного синдрома у пациента являются:
• наличие в плазме волчаночного антикоагулянта, определяемого в соответствии с рекомендациями ISTH дважды или более с промежутком не менее 12 нед;
• наличие антител к кардиолипину (IgG и/или IgM) в среднем или высоком титре и/или анти-р2-1-антител (IgG и/или IgM) в высоком титре в плазме или сыворотке крови в двух или более измерений стандартным методом ELISA с промежутком не менее 12 нед.

Определение волчаночного антитела и антифосфолипидного антитела показано всем пациентам с тромботическими явлениями [тромбозами, инфарктами миокарда и острыми нарушениями мозгового кровообращения по ишемическому типу, особенно у молодых людей, повторным невынашиванием беременности и др.], даже если активированное частичное тромбопластиновое время у них не удлинено. Уровень антифосфолипидных антител оценивают не только для диагностики антифосфолипидного синдрома, но и для контроля эффективности его терапии (иммуносупрессивной или с применением экстракорпоральных методов). 

Иммунные ингибиторы факторов свертывания
Аутоантитела к плазменным белкам — факторам свертывания крови (наиболее часто к VIII или IX) связывают соответствующие факторы и замедляют свертывание крови in vivo и in vitro. При значительном накоплении антител возможны почти полное блокирование плазменных факторов и развитие ингибиторной формы гемофилии с геморрагическим синдромом.

ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕСТА
При наличии в плазме пациента иммунных ингибиторов — аутоантител к факторам VIII или IX — немедленно после смешивания с нормальной донорской плазмой в микс-тесте 1:1 активированное частичное тромбопластиновое время в значительной степени приближается к референтным пределам, но после инкубации смеси тех же плазм в течение 1-2 ч при 37 °С активированное частичное тромбопластиновое время остается удлиненным. Добавление фосфолипидов не приводит к нормализации активированного частичного тромбопластинового времени, определение соответствующего фактора (VIII или IX) показывает снижение его уровня.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для количественного определения ингибиторных антител последовательные разведения исследуемой плазмы смешивают в соотношении 1:1 с нормальной пулированной плазмой, в получившихся микс-пробах после инкубации определют степень снижения активности факторов VIII или IX по сравнению с исходной нормальной плазмой. Активность плазменного ингибитора в единицах Bethesda равняется рассчитанной степени разведения исследуемой плазмы, при которой блокируется ровно 50% фактора. Остаточная факторная активность может быть определена отношением количества фактора в смеси исследуемой и нормальной плазм в пропорции 1:1 к количеству того же фактора в смеси нормальной плазмы с имидазоловым буферным раствором (после двухчасовой инкубации при 37 °С) и выражена в процентах.

КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
При наличии ингибиторных антител к плазменным факторам VIII и IX на фоне клинической картины геморрагического синдрома, кроме активированного частичного тромбопластинового времени плазмы, бывает удлинено время свертывания цельной крови, в то время как другие базовые коагуляционные тесты изменяются в гораздо меньшей степени или остаются нормальными.

Антитела к плазменным факторам часто выявляют у больных с тяжелой гемофилией, которым регулярно вводят концентраты или препараты факторов VIII и IX. Они также могут появляться при аллергических и иммунопатологических заболеваниях, онкопатологии, миеломной болезни и как реакция на некоторые лекарственные препараты. Антитела к факторам свертывания могут появляться у людей пожилого возраста, после иммуносупрессивной терапии они пропадают. Антитела, появившиеся у женщин спустя 2-5 мес после родов, могут самопроизвольно исчезнуть через 1-1,5 года.

ЛАБОРАТОРНЫЕ ТЕСТЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕМОСТАЗА
• Оценочные тесты 1-го уровня — выполняют в клинико-диагностической лаборатории первичного звена:
- количество тромбоцитов, время кровотечения, АЧТВ, ПВ (МНО), количе¬ство фибриногена по методу Клауса.

• Оценочные тесты 2-го уровня - выполняют в лабораториях диагностических центров и стационаров:
- агрегация тромбоцитов, ТВ, D-димер, лизис зуглобулинов.

• Дополнительные тесты — выполняют в специализированных лабораториях:
- при кровоточивости — активность фактора фон Виллебранда и плазменных факторов свертывания;
- при склонности к тромбозам — антитромбин, протеины С и S, аРС- резистентность, гомоцистеин, волчаночный антикоагулянт, антифосфолипидные антитела, генетическое тестирование.

• Контроль антитромботической терапии — в лабораториях всех уровней:
- терапия нефракционированным гепарином;
- терапия непрямыми антикоагулянтами.

• Тесты активации свертывания и фибринолиза.
• Тесты потребления/гиперпотребления плазменных факторов.
• «Клеточные» маркеры ДВС — динамика количества тромбоцитов и их спонтанной агрегации, гемоглобин, фрагментация эритроцитов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ И ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ТЕСТЫ ПРИ ДВС КРОВИ
• Активация свертывания — повышение содержания фибринопептида А, фраг-ментов протромбина 1+2, комплекса «тромбин-антитромбин».
• Потребление факторов — снижение содержания АТ, протеинов С и S.
• Активация фибринолиза — повышение фибринолитической активности, содержания комплекса «плазмин-антиплазмин», продуктов деградации фибрина и фибриногена; снижение содержания плазминогена.
• Тромбоцитарное звено — повышение содержания тромбоцитарного фактора-4, b-тромбоглобулина.

Оцените статью: (7 голосов)
4.14 5 7

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Методы исследования коагуляционного гемостаза. Часть 1
Основы функционирования системы гемостаза
Плазменное звено гемостаза
Преаналитический этап исследований гемостаза
Тромбоцитарный компонент гемостаза


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти