MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Физико - химические методы исследования

фото Физико - химические методы исследования
В настоящее время в химико-токсикологическом анализе используют широкий арсенал методов аналитической химии: химические, спектральные, иммунологические, различные виды хроматографии и др. Использование одного или комплекса методов определяется конкретными аналитическими задачами (направленный и ненаправленный анализы, обнаружение металлических, лекарственных ядов, летучих токсикантов, наркотических средств и др.).

Фактически все клинические и судебно-химические лаборатории используют тесты с окрашиванием в целях получения предварительного результата на присутствие потенциальных источников отравления.

Прямое обнаружение в моче:
• Определение глюкозы, кетонов и pH. Анализ глюкозы должен быть соотнесен с определением ее в крови. Положительный результат на кетоны может указывать на интоксикацию ацетоном или изопропанолом (тест также может быть положительным у больных сахарным диабетом).
• Цветовой тест на салицилаты (включая ацетилсалициловую кислоту) — тест Триндера.


При добавлении 100 мкл реактива Триндера (смеси 40 г хлорида ртути в 850 мл воды, 120 мл соляной кислоты и 40 г гидратированного нитрата железа, разбавленной водой до объема 1 л) к моче объемом 2 мл и перемешивании в течение 5 с образуется фиолетовое окрашивание в присутствии салицилатов. Тест лучше всего проявляется в образцах мочи и хуже — в содержимом желудка. Если при этом анализе получен положительный результат, следует предпринять количественный анализ образцов плазмы и сыворотки с использованием газово-жидкостной хроматографии.
• Обнаружение фенотиазинов проводят с помощью теста FNP. Появление фиолетовой, красной, оранжевой, чернильной, голубой окраски указывает на присутствие производных фенотиазина. Окраска возникает сразу. Положительный результат можно наблюдать после приема терапевтических доз.


Положительные результаты должны быть подтверждены посредством тонкослойной хроматографии.
• Трициклические антидепрессанты обнаруживают по реакции с реактивом Форреста. Добавление водных растворов дихроматов калия, серной, перхлорной и азотной кислот к 0,5 мл образца в течение 5 с в присутствии соединений данной группы ведет к образованию желто-зеленой окраски с переходом в темно-зеленую, а затем и в синюю. Важно помнить, что аналогичную окраску дают фенотиазины.
• Трихлорсодержащие соединения (включая хлоралгидрат, хлороформ, дихлоральфеназон, трихлороэтилен и другие гемтрихлорсодержащие соединения) обнаруживают с помощью теста Фуаживора. При положительном тесте необходимо провести подтверждающее исследование с помощью газово-жидкостной хроматографии.
• Парацетамол и фенацетин могут быть обнаружены тестом с аммиачным раствором о-крезола. При положительном результате следует провести количественное определение парацетамола в плазме или сыворотке.
• Для обнаружения токсичных веществ окислительного характера (гипохлоритов, хлоратов, нитратов, нитритов и др.) используют тест с дифениламином. Образование интенсивного голубого окрашивания указывает на присутствие подобного рода окислителей в образце.

Спектроскопия в ультрафиолетовой и видимой областях
В спектральных методах используются свойства молекул или атомов вещества специфически поглощать, испускать, отражать электромагнитное излучение. Характер спектра аналита специфичен, а его интенсивность в определенном интервале длины волны (подчинение закону Бугера-Ламберта-Бера) пропорциональна концентрации аналита в растворе, что создает возможность идентифицировать вещество и оценить его количественное содержание. В то же время определение содержания какого-либо соединения возможно только в чистом растворе, для использования спектральных методов при анализе смесей имеются ограничения. 

Иммунные методы
Все иммунные методы принципиально основаны на взаимодействии токсичного вещества (антигена) со специфичными к нему антителами в присутствии хромо-генного агента. Для фиксации химической реакции между ними в один из компонентов вводят специальную метку, по способу детектирования которой различают несколько видов иммунохимического анализа с гарантированными пределами обнаружения в диапазоне от 0,1 до 500 нг/мл вещества: иммунохроматографический, иммуноферментный, поляризационный флюороиммунологический, радиоиммунологический.

В гомогенном иммуноферментном анализе все компоненты реакции находятся в одном агрегатном состоянии — растворе. В наиболее распространенных модификациях гетерогенного анализа антитела скапливаются на твердом носителе (пробирках, планшетах, бусинах). Основная проблема иммуноферментного анализа — лабильность ферментов. Как и все белки, они теряют активность под действием таких факторов, как нагревание, замораживание, разведение образцов, изменение pH, присутствие солей тяжелых металлов, антикоагулянтов, микроорганизмов. Некоторые компоненты крови, метаболиты лекарственных средств и т. п. могут изменять скорость ферментативных реакций. Таким образом, в иммуноферментном анализе часты случаи ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Именно поэтому его результаты значимы только в комбинации с подтверждающими методами.

Наиболее чувствительный и удобный в использовании иммунологический метод — поляризационный флюороиммунологический анализ. Принцип проведения реакции тот же, что в гомогенном иммуноферментном анализе. В качестве метки используют флюоресцеин натрия. Изменение поляризации флюоресценции зависит от степени связывания меченого антигена с антителом. Для регистрации результатов используют специальную оптическую систему.

Общая проблема для всех иммунохимических методов — кросс-реактивность. Поскольку антитела формируют места связывания не на конкретную молекулу, а на некоторый характерный ее фрагмент, то и иммунная реакция может происходить с веществами, имеющими его в своей структуре. Именно поэтому при иммунном анализе определяют не конкретное вещество, а группу соединений, т. е. метод имеет групповую специфичность. Положительный ответ дается, например, на опиаты (а не на морфин), барбитураты (а не на фенобарбитал) и т. д. Кроме того, возможна реакция с другими химическими соединениями, не принадлежащими к этой группе лекарств. Обычно каждый выбор характеризуется относительной реактивностью к другим соединениям, что исключает возможный ложноположительный и ложноотрицательный результат.

Таким образом, при экспресс-анализе токсикантов иммунными методами при получении отрицательного аналитического значения требуется обязательное подтверждение результата другими методами.

Газожидкостная хроматография
Газовую хроматографию в анализе наркотических средств используют в газожидкостном варианте, когда анализируемая смесь находится в состоянии газа (подвижной фазы), который принудительно движется вдоль тонкой пленки жидкости, нанесенной на твердый носитель. Неподвижные жидкие фазы бывают разной полярности. Значительно эффективнее разделение происходит на капиллярных колонках. Колонка — стеклянный капилляр диаметром 0,1-0,5 мм и длиной несколько десятков метров. Жидкую фазу наносят на стенку капилляра (носитель). Удлинение колонки ведет к лучшему формированию концентрационных зон, в этом случае разделение происходит значительно эффективнее.

Детектирование в газово-жидкостной хроматографии осуществляют самыми различными типами аналитических устройств, основанными на различных способах фиксации веществ. Это детектор теплопроводности, плазменно-ионизационный, термоионный, детектор по захвату электронов, масс-селективный и др. Широкий выбор детекторов позволяет решать самые разнообразные задачи. Минимальный обнаруживаемый уровень анализируемых веществ — от 400 пг/мл до 0,1 пг/мл. Идентификацию веществ осуществляют сравнением характеристик удерживания (абсолютное, исправленное, относительное время удерживания и индексы удерживания) с таковыми эталонных (стандартных) веществ.

Газово-жидкостная хроматография — качественный и количественный метод анализа. Количественный ана-лиз может быть осуществлен путем абсолютной градуировки с использованием внешнего или внутреннего стандарта по измерению площади или высоты пика.

Тонкослойная хроматография
В методе тонкослойной хроматографии неподвижную твердую фазу тонким слоем наносят на стеклянную, металлическую или полимерную пластинку. На расстоянии 0,5-1 см от края пластинки на стартовую линию наносят пробу (концентрированный экстракт мочи) и метчики — вещества сравнения. Край пластинки погружают в систему растворителей, которая действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хроматографии. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты анализируемой смеси, что приводит к их пространственному разделению.

Диффузия в тонком слое происходит в продольном и поперечном направлениях, поэтому процесс рассматривают как двухмерный. Стационарная фаза обычно представляет однородный слой толщиной 0,25 мм силикагеля (средний размер частиц — 20 мкм). Пластинки для высокоэффективной тонкослойной хроматографии от обычных отличаются меньшим размером частиц (5-10 мм) и повышенной чувствительностью. Существуют также пластинки для тонкослойной хроматографии с обращенной фазой, на которых гидрофобная часть (обычно С2, С8, С18) связана с силикагелевой матрицей. Результаты тонкослойной хроматографии регистрируют в виде коэффициентов удерживания.

Более удобен показатель Rf 100 (hRJ), особенно при использовании стандартной длины пластин 10 см, поскольку в этом случае его величина равна расстоянию (в миллиметрах), пройденному анализируемым веществом от старта. Существует много факторов, влияющих на воспроизводимость Rf, однако их влияние может быть минимальным, если вместе с каждым образцом анализируют стандартные (эталонные) соединения. Тонкослойная хроматография обычно применяют для качественного и полуколичественного определения.

Высокоэффективная жидкостная хроматография
Высокоэффективная газовая хроматография существует в нескольких вариантах:
• нормально-фазовая — жидкая неполярная фаза, состоящая из смеси неполярных растворителей; движется вдоль полярной неподвижной фазы (силикагеля);
• обращенно-фазовая — жидкая полярная фаза, состоящая из смеси воды и полярных растворителей, движется вдоль неполярной неподвижной фазы (модифицированного силикагеля с химически привитыми углеродными цепями С2, С8, С10, С18 или другими привитыми группами — CN, диолами, SH и др.);
• ионообменная хроматография — полярная подвижная фаза; движется вдоль неподвижной, состоящей из катионообменной или анионообменной смолы;
• другие разновидности высокоэффективной газовой хроматографии.

Основное преимущество высокоэффективной газовой хроматографии перед другими хроматографическими методами в том, что разделение происходит при комнатной температуре, в отличие, например, от газово-жидкостной хроматографии, где анализируемую смесь необходимо с помощью нагревания пере-водить в газообразное состояние, что может привести к термодеструкции некоторых термолабильных веществ.

Широкий набор детекторов [ультрафиолетовый (УФ-детектор), химический, ИК- и особенно МС-детекторы] делает высокоэффективная газовая хроматография надежным методом качественного и количественного обнаружения наркотических средств.

Хроматомасс-спектрометрия
Молекулы вещества, попадая в масс-спектрометр и находясь в газообразном состоянии, подвержены ионизации под действием электронов (деструктивная ионизация) или специального газа (химическая деструкция). При этом молекула вещества распадается по определенным правилам на фрагменты с разными массами. Получаемые ионы разделяются по массе и составляют масс-спектр. По сравнению со спектрами стандартных веществ можно идентифицировать вещество, а зная законы фрагментации-ионизации — предположить структуру анализируемого вещества.

Оцените статью: (11 голосов)
4.27 5 11

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Алгоритм пренатального мониторинга беременности
Анализ наркотических средств
Механизм взаиморегуляции в системе «мать - плацента - плод»
Мониторинг беременности
Регуляции метаболизма организмов матери и плода


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти