MEDDAILY.INFO
медицинская энциклопедия
ГлавнаяКарта сайта Контакты
 

Частные методики обнаружения токсичных веществ

Объекты исследования в аналитической токсикологии — кровь (цельная, сыворотка или плазма) и моча. Для этих биологических объектов характерно содержание анализируемых веществ и их метаболитов в низких концентрациях и наличие большого количества фоновых эндогенных соединений (пептидов, аминокислот, сахаров, стероидов, пигментов, низкомолекулярных продуктов их метаболизма). Цель пробоподготовки — максимально возможное удаление фоновых веществ и концентрирование анализируемых образцов. Способ зависит от природы объекта, анализируемого вещества и используемого метода анализа. При использовании в анализе хроматографических методов обычно применяют жидкость-жидкостную экстракцию, концентрирование, твердофазную экстракцию, дериватизацию или сочетание этих приемов.

Жидкость-жидкостная экстракция основана на распределении вещества между двумя несмешиваемыми жидкими фазами, которое зависит от природы исследуемого вещества, состава жидких фаз, значения pH, внешних факторов (температуры, техники перемешивания и др.).


Общепринято использование постадийной экстракции при кислых и щелочных значениях pH хлороформом, эфиром диэтиловым или другими подходящими растворителями, что приводит к разделению веществ на две большие группы кислого и нейтрального основного характера. Полученные экстракты упаривают, растворяют в малом количестве органического растворителя и используют для анализа методами тонкослойной хроматографии, ГЭХ, высокоэффективной газовой хроматографии, газовой хроматографии/масс-спектрометриb и т. п. Часто для газово-жидкостной хроматографии, особенно газовая хроматография/масс-спектрометрия, используют образцы, которые дополнительно очищают хроматографически.

Сущность твердофазной экстракции заключается в адсорбции компонентов пробы на твердом носителе с последующим фракционным элюированием соответствующими растворителями или их смесями.


В качестве сорбентов в зависимости от природы аналита можно использовать макропористые сорбенты типа полисорба, ионообменные смолы, модифицированные силикагели с привитой фазой. Твердофазная экстракция обеспечивает лучшую очистку от фоновых веществ и концетрирование компонентов пробы. Далее элюаты упаривают и анализируют необходимым методом.

Для анализа веществ с низкими температурами кипения, так называемых летучих токсикантов (в основном органических растворителей), используют газово-жидкостную хроматографию в парогазовой фазе. При этом в герметично закрытую пробу вводят внутренний стандарт, депротеинизирующие агенты (трихлоруксусную, серную кислоты и др.) и нагревают. На анализ отбирают газовую фазу. В случае спиртов их предварительно переводят в летучие эфиры — алкилнитриты, которые находятся в газовой фазе при нормальной температуре, и анализируют методом газово-жидкостной хроматографии.

Барбитураты
Производные барбитуровой кислоты (более 2500 соединений) находят широкое применение в медицинской практике как противосудорожные, успокоительные, снотворные средства, препараты для наркоза. К чисто наркотическим средствам отнесены только два барбитурата — барбамил и этаминал-натрий. Оба препарата убраны из фармакопейных каталогов. Тем не менее Всемирная организация здра-воохранения рекомендовала взять под контроль эту группу лекарственных средств, оказывающую влияние на центральную нервную систему, как потенциально опасную. Кроме того, препараты барбитуровой кислоты часто обнаруживают в биологических объектах наркоманов, использующих так называемые лекарственные коктейли. Постоянный комитет по контролю наркотиков включил барбитураты в группу веществ для обязательного обнаружения.

Для обнаружения барбитуратов по системе скрининга используют иммунохимические методы. Они имеют отрицательное химико-токсикологическое значение, т. е. при отрицательном результате анализа на содержание барбитуратов дальнейшее исследование не проводят. В случаях положительного результата необходим хроматографический скрининг соединений слабокислого и нейтрального характера. Скрининг может быть проведен напрямую методами газовой хроматографии/плазменной ионизации, газово-жидкостной хроматографии, высокоэффективной газовой хроматографии на экстрактах крови, чтобы идентифицировать специфические барбитураты, присутствующие в биологических образцах тела человека.

В рутинном химико-токсикологическом анализе применяют метод комплексного сочетания тонкослойной хроматографии и УФ-спектрофотометрии. При тонкослойной хроматографии исследуют экстракт биологической жидко¬сти, полученный при кислых значениях pH. Кроме общих систем растворителей используют частные для барбитуратов: «бензол-этилацетат» (2:1), «хлороформ-изопропанол-аммиак» (5:5:1). Классический реагент для проявления барбитуратов — сульфат ртути в серной кислоте и дифенилкарбазон. Образующееся сине-фиолетовое окрашивание пятен, по Rf совпадающих со стандартами, свидетельствует о присутствии барбитуратов. Количественное определение производных барбитуровой кислоты основано на измерении разности оптической плотности щелочного раствора барбитурата (в боратном буфере) при двух значениях pH среды: pH = 13 и pH = 10 при длине волны 260 нм.

ГЖХ-определение производных барбитуровой кислоты проводят на жидких фазах типа SE-30 или OV-17. Используют ступенчатый температурный режим колонки 180 °С; 200 °С — для барбитала, барбамила, нембутала; 230 °С — для фенобарбитала или другие варианты программирования. Температура испарителя — 250 С. Для подготовки пробы в образец вводят серную кислоту в дозе 0,25 моль, такой же объем очищенного хлороформа. Смесь центрифугируют при 8000 об./мин. На анализ отбирают 1-5 мкл хлороформного извлечения.

Газовую хроматографию/масс-спектрометрию проводят на элюатах с ТСХ-пластин по нативным соединениям или дериватам. Хроматографические условия общие, как для других лекарственных соединений.

Для анализа барбитуратов может быть применен метод высокоэффективной газовой хроматографии. Используют колонку с обращенно-фазным сорбентом типа С28. Подвижная фаза: смесь «ацетонитрил-дистиллированная вода» (35:65) или «0,05 моль водный двузамещенный фосфат аммония-метанол» (60:40). Детектирование в УФ-свете при 220 или 240 нм. Пробоподготовка к анализу включает осаждение белков 40% раствором перхлоруксусной кислоты. 

Производные 1,4-бензодиазепина
Бензодиазепины — группа транквилизаторов высокой активности с широким терапевтическим действием и относительно малой токсичностью. Они отнесены к группе веществ, подлежащих контролю над производством, распространением и употреблением наркотиков. Относительная доступность делает их частой причиной злоупотребления и передозировок. Экспресс-анализ бензодиазепинов обеспечивают с помощью иммунохимических методов. Химический анализ бензодиазепинов проводят по двум направлениям: по нативным веществам и метаболитам и по продуктам их гидролиза — бензофенонам. Второй вариант оценивает суммарное количество бензодиазепинов и их метаболитов, так как продукт их кислотного гидролиза дает один и тот же бензофенон.

Доступные иммунохимические анализы демонстрируют положительные резуль-таты в анализе мочи для метаболитов, служащих общими для различных бензоди-азепинов. Исключение — лоразепам и флунитразепам. Газовая хроматография/масс-спектрометрия и газово-жидкостная хроматография могут быть использованы для анализа мочи или крови с целью дифференцировать бензодиа-зепины, не обнаруживаемые при иммунохимическом исследовании. Использовать или нет более трудоемкие хроматографические методы при отрицательном иммунотесте — зависит от потенциальной значимости бензодиазепина.

Для тонкослойной хроматографии предложены общие системы и несколько частных, например «хлороформ-метанол» (9:1), «этилацетат-метанол-аммиак» (85:10:5), метанол. Обнаружение можно проводить реагентами, дающими различное окрашивание. Эффективно проводить гидролиз на пластинке и обнаруживать бензодиазепины по бензофенонам, но убудут, как у нативных веществ.

Для обнаружения производных бензодиазепина методом газово-жидкостной хроматографии используют общую систему: фазу типа SE-30 или OV-17, температуру колонки 230 °С, детектор пламенно-ионизационный или электронно-захватный. Возможные осложнения в анализе, связанные с термола-бильностью бензодиазепинов и их водорастворимых метаболитов, решают за счет использования реакционной хроматографии.

Газовая хроматография/масс-спектрометрия проводят на элюатах с ТСХ-пластин по нативным соединениям или дериватам. Хроматографические условия общие, как для других лекарственных соединений. Возможен ВЭЖХ-анализ производных бензодиазепина по нативным веществам или продуктам гидролиза. Используют колонку с обращенно-фазным сорбентом типа С18. Подвижная фаза: ацетонитрил-0,05 моль водный двузамещенный фосфат аммония. Для детектирования используют УФ-детектор.

Опиаты
Термин «опиаты» объединяет большую группу растительных продуктов, выделяемых из опийного мака (опий, маковая соломка, другие части растений), — морфин, кодеин, а также полусинтетические продукты на основе морфина. В зависимости от региона произрастания содержание основных алкалоидов колеблется: морфин — 4-21%, кодеин — 0,7-3%, наркотин очищенный — 2-6%, тебаин — 0,2-1%, папаверин — 0,5-1,3%. Экстракт из маковой соломки может содержать морфин до 5%. Сильным фармакологическим действием обладает морфин, еще более сильным — героин (продукт ацетилирования морфина).

Все опиаты относят к тяжелым наркотическим веществам, вызывающим физическое привыкание после 3-5 инъекций. В настоящее время опиаты — один из основных видов наркотических веществ в России. Попадая в организм, опиаты быстро метаболизируются. Период полужизни морфина — 2-3 ч, героина — 0,1-0,5 ч. В течение 8 ч выводится 80% введенной дозы морфина, за 24 ч — до 90%, через 72 ч определяют лишь его следы. 

Аналогично ведет себя героин. Именно поэтому химико-токсикологический анализ на обнаружение опиатов — практически всегда поиск следовых количеств, требует очень чувствительных методов, обладающих высокой специфичностью. Анализ на присутствие опиатов включает обнаружение морфина, 6-моноацетилморфина, кодеина, гидроморфона. В качестве предварительных методов анализа используют иммунохимические методы и ТСХ-скрининг.

Иммунохимические методы могут детектировать как родоначальное соединение, так и его метаболиты. Для дифференциации опиатов обычно используют метод газовой хроматографии/масс-спектрометрии, включающий предварительный кислотный или ферментативный гидролиз и дериватизацию для обеспечения максимальной чувствительности и специфичности. Конкретные методики обнаружения опиатов указаны в рекомендуемых литературных ссылках.

Каннабиноиды
К этой группе мягких наркотических средств относят препараты, изготовленные из различных частей конопли. В зависимости от способа приготовления и концентрации психоактивных компонентов различают марихуану, гашиш (анашу), гашишное масло. Из большого числа каннабиноидов (может быть, до 400 компонентов) выделяют А-9-тетрагидроканнабинол, А-8-ТГК, каннабинол, каннабидиол, но наивысшей физиологической активностью обладает А-9-ТГК. Его содержание колеблется от 0,5 до 5% в марихуане, от 2 до 10% в гашише и до 30% в гашишном масле.

Основной способ употребления — курение, другие способы встречаются редко. При курении А-9-ТГК быстро всасывается, накапливаясь в тканях, богатых липи-дами, откуда медленно депонируется в кровь, где в течение длительного периода поддерживается постоянная концентрация как самого А-9-ТГК, так и его важнейшего метаболита — А-9-ТГК-кислоты. Такое поведение каннабиноидов позволяет надежно их определять в моче с помощью различных иммунохимических методов по основному метаболиту до 30 дней.

Для установления факта курения с помощью тонкослойной хроматографии анализируют спиртовые смывы с рук, губ и полости рта. В качестве подтверждающих методов используют более селективные и чувствительные методы — газовая хроматография/масс-спектрометрия и газово-жидкостная хроматография.

При подготовке пробы мочи к анализу этими методами необходимо проводить щелочной гидролиз конъюгатов Д-9-ТГК-кислот. Образуемую Д-9-ТГК-кислоту экстрагируют и после упаривания растворителя переводят в метиловый эфир. ГХ-анализ осуществляют в виде эфира. Характерные масс-фрагменты для метило¬вого эфира Д-9-ТГК-кислоты — m/z 372, 357, 313. При анализе плазмы крови гидролиз не выполняют, в остальном анализ проводят так же. Определяют как Д-9-ТГК-кислоту, так и Д-9-ТГК. Характерные масс-фрагменты для Д-9-ТГК — m/z 314, 299, для метил-Д-9-ТГК — m/z 328, 313.

Кокаин
Кокаин — алкалоид, получаемый из сухих листьев растений рода Erythroxylon или синтетически из экгонина. Гидрохлорид кокаина — эффективный местный анестетик. Системно оказывает возбуждающее и стимулирующее действие. Острое отравление вызывает эйфорию, беспокойство, рвоту, расширение зрачков, тремор, артериальную гипертензию, гипервентиляцию, судороги, сердечную недостаточность. Минимальная летальная доза для взрослых составляет 1-2 г.
Кокаин используют путем инъекций или ингаляций, прием внутрь оказывает более слабое действие за счет гидролиза в желудочно-кишечном тракте. Кокаин в виде сводного основания (крека) быстро адсорбируется через слизистые при вдыхании или курении. 

Основные метаболиты кокаина: бензоилэкгонин, экгонин и его метиловый эфир — неактивны, норкокаин — активный метаболит, образуется в малых количествах и неустойчив, другие метаболиты — метилэкгонин, этилэкгонин, гидро-ксикокаин. С мочой выводится примерно 1-9% внутривенной дозы в виде кокаина, 35-55% — в виде бензоилэкгонина. Уменьшение pH мочи способствует выведению нативного вещества. Объем распределения кокаина — 1-3 л/кг, клиренс — 10-30 мл/мин на 1 кг, период полувыведения — 0,7-1,5 ч. Кокаин продолжает активно метаболизировать в отобранной пробе мочи, поэтому в пробу для анализа добавляют консервант — фторид натрия, и обнаружение метаболитов кокаина указывает на его употребление. Для скринингового анализа на кокаин (бензоилэкгонин) используют иммунные методы. Экстракцию из мочи проводят при pH = 9-10. ГХ-анализ проводят по нативным веществам или метиловым эфирам. Характерные масс-фрагменты для кокаина и метилэкгонина — m/z 421 и 300.

Фенилалкиламины
К этой группе психоактивных средств относят амфетамин, метафетамин (первитин), эфидрин, эфедрон и другие стимуляторы этой группы. В последние годы получили распространение метилендиоксипроизводные амфетаминов — метилендиоксиметамфетамин, экстази, 3,4-метилендиоксиамфетамин, 3,4-метиленэдиокси-эфиламфетамин и др. Длительность их действия составляет примерно 4-6 ч. Максимальная концентрация в крови достигается через 2 ч. За сутки из организма выводится до 90% дозы, что свидетельствует об их активной биотрансформации.
Для предварительного обнаружения фенилалкиламинов используют иммунохимические исследования на группу амфетаминов в целом; на амфетамин/ метамфетамин; отдельно на амфетамин, метамфетамин. Проводят также ТСХ-скрининг.

Выделение из мочи осуществляют бензолом при pH = 11. После обезвоживания к экстракту добавляют 5% метанольный раствор НС1, так как вещества данной группы в виде оснований летучи и/или легко окисляются, затем экстракт упаривают. Остаток растворяют в этаноле. Для целенаправленного ТСХ-исследования используют системы «метанол-аммиак» (49:1), «бензол-диэтиламин-этанол» (9:1:1). Значения Rf в последней системе: эфедрон — 0,65, эфедрин — 0,41.

Для ГЖХ-анализа используют различные методики с дериватизацией и без нее, в изотермическом режиме или с программированием температур. В качестве детектора можно использовать пиридинолин, азотно-фосфорный и масс-детекторы.

Одна из предлагаемых методик: колонка стеклянная насадочная силанизированная 1хЗ мм. Сорбент 10% карбовакс 1500 на инертоне AW-HMDS. Температура испарителя и детектора — 200 °С, температура колонки — от 130 до 200 °С, 15 °С/мин, конечная температура — 12 мин или изотерма 170 °С для эфедрона, эфедрина, норэфедрина и 130 °С для амфетамина и метамфетамина. Предел обнаружения — от 0,08 мкг/мл для метамфетамина и до 0,5 мкг/мл для эфедрина при анализе 10 мл мочи.

Анализ фенилалкиламинов методом газовой хроматографии/масс-спектрометрии осложнен тем, что они плохо разделяются и имеют сходные масс-спектры. Именно поэтому рекомендуют проводить дериватизацию и анализировать в виде пентафторпропионатов, трифторацетатов и др. В качестве подвижной фазы используют различные смеси растворителей, но обычно сочетание метанола или ацетонитрил-водно-фосфатного буфера. Детектор — УФ-фотометр для нативных соединений, реже хемилюминесцентный или флюоресцентный для соответствующих дериватов.

Фенотиазины
Группа лекарственных соединений, производных фенотиазина, используемых в качестве транквилизаторов, антидепрессантов, антигистаминных средств. Наиболее известные представители этой группы: хлорпромазин, промазин, левомепромазин, прохлорперазин, тиоридазин, хлорпротиксен, трифлуоперазин и др.

Производные фенотиазина химически очень лабильны и подвергаются в организме активному метаболизму. Основные метаболические реакции — сульфоокисление, N-деметилирование, гидроксилирование, окисление и конъюгация с глюкуроновой кислотой. Для экспресс-определения фенотиазинов в моче используют реакцию с FNP-реактивом, который состоит из смеси водных растворов хлорида железа, перхлорной и азотной кислот (1:9:10). Появляющаяся окраска от розового до синефиолетового цвета свидетельствует о возможном присутствии фенотиазинов или их метаболитов. Возможны ложные реакции, например имипрамин (трициклический антидепрессант) дает зеленое окрашивание, а тиоридазин не дает окраски.

Дальнейшие исследования осуществляют методами тонкослойной хроматографией, газово-жидкостной хроматографии, высокоэффективной газовой хроматографии, газовой хроматографии/масс-спектрометрии. При подготовке пробы мочи и крови к анализу проводят гидролиз, затем извлечение смесью «гептан-изопентанол 3% раствор». Для тонкослойной хроматографии используют системы: «бензол-диоксан-аммиака 25% раствор» (60:35:5) и «этилацетат-ацетон-аммиак 25% раствор в этаноле» (50:45:4) или общие системы для основных веществ: «толуол-ацетон-этанол-аммиак 25% раствор» (45:45:7,5:2,5) и «диоксан-хлороформ-ацетон-аммиак 25% раствор» (47,5:45:5:2,5). Детектирование проводят опрыскиванием пластин этанольным раствором концентрированной серной кислоты или реактивом Марки. Все фенотиазины дают красное или темно-красное окрашивание, кроме левомепромазина, имеющего голубой цвет. Количественное определение предлагают делать фотометрически по интенсивности окраски про¬изводного фенотиазина с метилоранжем.

Спирты, их суррогаты, промышленные хлорорганические продукты, технические жидкости
Основной, наиболее специфичный, широко используемый метод определения растворителей и технических жидкостей в различных биологических объектах — газовая хроматография, позволяющая сочетать идентификацию и количественную оценку. Газохроматографические методы обладают ценными преимуществами, особенно для целей клинической токсикологии: точностью, быстротой, простотой выполнения и универсальностью. В одной и той же пробе малого объема определяют сразу несколько соединений.

Официальный метод для анализа промышленных хлорорганических соединений и других летучих растворителей — парогазовый анализ. Для анализа этанола и других алифатических спиртов используют пробоподготовку, сочетающую дериватизацию с переведением в летучие соеди-нения: для спиртов — в алкилнитриты, для этиленгликоля — в фенилборонатный эфир. Для извлечения нелетучих соединений класса гликолей применяют специ-альные методики.

В ряде работ используют прямой ввод депротеинизированных биологических проб в хроматографическую колонку. В условиях работы лабораторий клинической токсикологии этот подход наиболее интересен, так как обеспечивает быстроту анализа. Негативная сторона прямого ввода — снижение чувствительности метода анализа, образование осадков сопутствующих веществ мочи и плазмы крови на колонках и устройствах ввода, спекание биологической пробы в игле при шприцевом вводе. Для того чтобы устранить эти недостатки, применяют предколонки с адсорбентами или инжекторы с программированием температуры ввода. 

Большинство методик определения летучих растворителей и гликолей предполагает детектирование по ионизации плазмы. При анализе спиртов C1-C5 в виде алкилнитритов используют детектор по теплопроводности — катарометр. Для обнаружения следовых доз хлорсодержащих соединений применяют детектор по захвату электронов, селективный к хлору. Малые размеры молекулы четыреххлористого углерода обусловливают недостаточную чувствительность к нему. Поскольку отравления этим соединением происходят в основном ингаляционным путем и уровень концентраций в биологических жидкостях низок, необходимо использование детектора по захвату электронов, селективного к хлору.

Определение этанола в организме человека
Этанол и вода смешиваются между собой в любых пропорциях, поэтому после употребления спиртных напитков все жидкости органов и тканей будут содержать этанол пропорционально массе воды в них. Количество воды у взрослого мужчины составляет в среднем 60% его массы, у женщин — 50%. Скорость нарастания концентрации алкоголя в крови непостоянна и зависит от многих условий: количества и крепости принятых напитков, количества и состава принятой до и после употребления алкоголя пищи, уровня всасываемости, моторной деятельности желудочно-кишечного тракта, возраста человека, количества жировой ткани. При незаполненном желудке концентрация алкоголя в крови нарастает быстро и достигает максимума через 30-80 мин; если алкоголизации предшествовал прием пищи, всасывание протекает медленнее — максимум алкоголя в крови наблюдают через 90-180 мин.

Естественно, наиболее прямой и определенный способ доказательства приема алкоголя — выявление содержания алкоголя в образце крови, выдыхаемом воздухе, моче и слюне. Длительность нахождения алкоголя в организме человека обусловлена в первую очередь количеством выпитого и может быть определена с учетом окисления 7-10 г/ч.

В наркологической практике при медицинском освидетельствовании принято определять алкоголь или его концентрацию в выдыхаемом воздухе, слюне, моче и крови, но это не позволяет окончательно судить о степени опьянения из-за неодинаковой реакции различных индивидов и непостоянной реакции одного человека на одни и те же дозы алкоголя, а также фазы алкогольной интоксикации. Однако определение в биологических средах организма содержания алкоголя, превышающего эндогенный уровень, свидетельствует о факте употребления спиртных напитков. Установление факта употребления само по себе может быть первостепенной задачей при обследовании отдельной категории пациентов с профессией, требующей повышенного внимания.

Запах алкоголя — возможно, самый давний и наиболее очевидный признак его употребления, поэтому считают, что лучший способ его выявления — измерение содержания (концентрации) алкоголя в выдыхаемом воздухе. Однако положительная проверка на алкоголь должна быть подтверждена повторным анализом через 20 мин, чтобы отличить присутствие алкоголя в ротовой полости от алкоголя, принятого ранее, и соответственно не может быть свидетельством алкогольного опьянения.

При отборе пробы крови обследуемый должен быть проинформирован о необходимости данной процедуры, после чего следует получить его письменное согласие. Все операции по отбору крови осуществляет только обученный персонал.

При поступлении в лабораторию все доставленные образцы тщательно осматривают и при необходимости в журнале приема делают замечания. Должны быть зарегистрированы любые нарушения упаковки образца, поломка, утечка крови, дата и время поступления. Информация о пробирках должна быть сравнима с другой документацией, сопровождающей пробу. Присвоение специального или штрихового кода позволит контролировать прохождение образца через лабораторию.

При анализе с использованием различных хроматографических систем необходимо отметить любые неопознанные пики, поскольку они могут указывать на присутствие других летучих веществ в образце крови. Качественную гарантию достоверности результатов обеспечивает следующий прием. Известно, что точность анализа будет уменьшаться с увеличением концентрации этанола, поэтому чем выше концентрация, тем более явные различия в результатах.

В последние годы широко стали использовать индикаторные полоски для визуального качественного и полуколичественного экспресс-определения алкоголя в слабоокрашенных биологических жидкостях — слюне, моче, сыворотке и плазме крови. Принцип действия основан на строго специфическом ферментативном окислении этанола (фермента алкогольоксидазы), сопровождающемся образованием пероксида водорода, который вызывает стехиометрическое образование окрашенного хромогена синего или зеленого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна количеству этанола в пробе.

Диапазон определяемых концентраций алкоголя в биологических жидкостях составляет 0-1 или 0-2 %о. Шкала на этикетке содержит цветовые поля, соот-ветствующие концентрациям алкоголя: 0-0,1-0,3-1,0 или 0-0,15-0,3-1,0-2,0%о. Минимально определяемая концентрация в биологических жидкостях составляет 0,1-0,15%.

Определение алкоголя проводят следующим образом: реагентную зону индикатора смачивают избытком исследуемой жидкости, через 10 с избыток жидкости удаляют резким движением руки (или фильтровальной бумагой), через 3 мин (не более 5 мин) с момента нанесения пробы определяют содержание алкоголя с помощью цветовой шкалы. Данный метода анализа — предварительный (скрининговый), для окончательного результата необходимо проводить подтверждающий анализ. Среди известных хроматографических методик для определения алкоголя в биологических жидкостях к настоящему времени Министерство здравоохранения РФ рекомендует к использованию две модификации алкилнитритного метода (методическое письмо от 22.04.68 № 10-95/14-32 с дополнениями от 12.08.71, методические указания «О повышении качества исследований при количественном определении этилового спирта в крови и моче», 1976).

Алкилнитритный метод заключается в превращении спиртов в алкилнитриты (более летучие, чем спирты) и дальнейшем их хроматографировании. Разделенные на хроматографической колонке компоненты смеси последовательно поступают в детектор по теплопроводности — катарометр, сигналы которого регистрируют в виде хроматографических пиков на хроматограмме. Идентификацию вещества проводят по времени его удерживания, которое исчисляют от момента введения анализата в колонку до появления максимума пика. Чувствительность для этилового спирта составляет 0,01 %о. Расчет концентрации этанола проводят после калибровки по методу внутреннего стандарта. Внутренним стандартом служит пропиловый (или изопропиловый) спирт.

Отбор проб и их подготовка к анализу. Из жидких биологических сред при освидетельствовании для установления факта употребления алкоголя и алкогольного опьянения наиболее часто исследуют мочу и слюну. Кровь можно забирать только при соответствующих медицинских показаниях. Содержание эндогенного алкоголя в крови, согласно опубликованным данным, — в пределах 0,008-0,4%о. Результаты определения эндогенного алкоголя зависят прежде всего от используемого метода. При применении неизбирательных способов, обладающих большой погрешностью измерения (способов Видмарка, Никлу, фотоколориметрического метода), максимальными уровнями эндогенного алкоголя в биологических жидкостях принято считать 0,3-0,4%о. При газохроматографическом исследовании эндогенного алкоголя определяют не более 0,02-0,07%о.

Результаты исследования во многом зависят от точности соблюдения методики пробоотбора биологических жидкостей, условий хранения пробы и транспортиров-ки, погрешности метода, ошибок при проведении исследований. С учетом изложенного, обнаружение алкоголя в биологической жидкости в концентрации менее 0,3%о не может достоверно свидетельствовать о факте употребления алкоголя.

Забор биологических сред у освидетельствуемых для установления состояния алкогольного опьянения должны проводить в любое время суток. Отбор пробы необходимо проводить в условиях, исключающих подмену или замену ее другими жидкостями. Маркированные образцы должны быть опечатаны таким образом, чтобы предотвратить неправомочную обработку (или фальсификацию). Для анализа должны быть отобраны два одинаковых образца, один из которых маркируют «К» (контрольный образец), хранят в течение 2 мес и анализируют в случае необходимости повторного контрольного исследования. Мочу отбирают в стерильный сухой пенициллиновый флакон, который тотчас же закрывают пробкой. Слюну собирают в стерильный сухой пенициллиновый флакон в количестве 3-5 мл и тут же закрывают пробкой.

Кровь отбирают из вены с помощью специальных вакуумных пробирок в коли-честве 3-5 мл. Для этих целей используют вакуумные пробирки с добавлением антикоагулянтов — гепарина натрия, цитрата натрия, ЭДТА. Место пункции должно быть обработано водным раствором фурацилина или этакридина, а не органическим растворителем типа эфира, изопропанола или этанола. Понятно, что образцы крови не должны быть взяты из вены, находящейся в данный момент под капельницей.

Пробы биологических сред следует хранить в холодильнике при температуре от 0 до +4 °С. В случае длительного хранения образца крови необходимо добавление консерванта — фторида натрия. У всех пенициллиновых флаконов с отобранными пробами фиксируют пробки алюминиевыми колпачками с помощью приспособления ПОК-1, обеспечивающего герметизацию флакона. В случае герметизации другим способом флаконы должны быть опечатаны. На каждый флакон наклеивают этикетку с указанием номера пробы (по регистрационной книге), даты, времени забора пробы, фамилий освидетельствуемого и медицинского работника, подготовившего пробу.

В лабораторию пробы мочи, крови и слюны передают вместе с направлением. Биологические среды, как правило, должны быть исследованы не позднее суток с момента их отбора. Допускают их хранение до исследования в холодильнике при температуре от 0 до +4 °С в течение 5 сут. При длительном хранении биологических сред без добавления консерванта, с нарушением температурного режима хранения в них развиваются бродильные и гнилостные процессы, которые могут существенно исказить результаты количественного определения. Наиболее надежно установить факт употребления алкоголя и состояние опьянения, количественное определение алкоголя в биологических жидкостях методом газовой хроматографии. Этот метод обладает высокими специфичностью и точностью.

Приказом М3 РФ от 14.07.2003 № 308 установлен порог с концентрацией 0,5%о при анализе крови на алкоголь, выше которого выносят заключение об алкоголь¬ном опьянении.

Аппаратура. Газовый хроматограф с детектором по теплопроводности. Газноситель — гелий или азот, скорость потока — 24 мл/мин. Колонка металлическая, диаметром 3 мм и длиной 2 м, температура колонки — 60 °С. Неподвижная фаза — полиэтиленгликоль-1500, твердый носитель — инзинский кирпич или целит С-22, фракция — 60-80 меш, модифицированный металлическим серебром, соотношение фаз — 1:10. В приборах с раздельными термостатами детектора и колонок температура термостата — 60-70 °С, детектора — 100 °С.

Для анализа используют кровь, сыворотку крови, мочу и слюну. Количественный анализ проводят с помощью калибровки по методу внутреннего стандарта, используя для расчета отношение высот пика этанола к пику про-панола. График зависимости от концентрации этанола строят по четырем точкам, используя точные растворы этилового спирта в воде.

Для построения графика используют эталонные растворы этанола в концентрации 0,4-1,0-2,0-4,0%, которые подвергаются газохроматографическому исследованию в тех же условиях, что и исследуемые пробы. На графике на оси абсцисс откладывают значения соотношения высот пиков этилнитрита к пропилнитриту, во избежание дробных чисел среднее значение соотношения высот пиков для каждой концентрации этанола умножают на 100. Масштаб: 1 см = 0,1 %о. На оси ординат — соответствующие им значения концентрации эталонных растворов. Масштаб: 1 см = 0,4%.

Пробу биологической среды подготавливают к вводу в прибор следующим образом: в пенициллиновый флакон, содержащий 0,5 мл трихлоруксусной кислоты, вносят 0,5 мл раствора пропанола (внутренний стандарт) и 0,5 мл исследуемой пробы; флакон закрывают резиновой пробкой, которую фиксируют. Содержимое флакона перемешивают и во флакон шприцем вводят 0,25 мл раствора нитрита натрия. Флакон энергично встряхивают (30 маятникообразных движений) и оставляют на 1 мин. Затем из флакона шприцем путем прокола пробки отбирают 0,3 мл парогазовой фазы, которую сразу вводят в прибор. Для получения достоверных результатов проводят три параллельных исследования. На хроматограмме измеряют высоту пиков.

В последние годы для количественного определения этанола в биологических жидкостях стали использовать аппаратно-программные комплексы на базе газовых хроматографов, состоящие из хроматографа, компьютера и интерфейсного блока с программным обеспечением. Время проведения одного анализа с автоматической обработкой результата составляет 2-3 мин.

В настоящее время также широко используют газово-жидкостную хроматографию в паровой фазе. Этот вариант требует, чтобы образец крови, водные стандарты с добавленным (1:5 и 1:10) внутренним стандартом выдерживались для установления равновесной паровой фазы в герметически закрытом сосуде при 50 или 60 °С в течение 15-20 мин. Газовым шприцем отбирают часть паровой фазы и вводят в хроматограф. Сигнал пика этанола соседствует с пиком внутреннего сосуда (пропанола). Длительное нагревание при 60° С может привести к частичному неферментативному окислению этанола оксигемоглобином. Предварительное добавление азида натрия может помочь этого избежать. Для разделения сложных смесей необходимо использовать капиллярные колонки. Добавление к образцу крови хлорида или карбоната натрия — полезный прием для доказательства следовых количеств эндогенного алкоголя.

Преимущество газово-жидкостной хроматографии перед другими методами настолько велико, что он стал надежнейшим методом обнаружения этанола в химико-токсикологических и судебно-химических лабораториях. Количественное определение этанола в выдыхаемом воздухе. Небольшие количества алкоголя при употреблении человеком спиртных напитков выделяются вместе с выдыхаемым воздухом, что позволяет быстро и неинвазивно контролировать присутствие алкоголя в организме для клинических и судебных целей.

Для экспресс-обнаружения этанола в крови и выдыхаемом воздухе во внелабораторных условиях используют различные переносные устройства — алкометры. В большинстве надежных портативных устройств используется электрохимическая ячейка, в которой этанол окисляется до ацетальдегида. Количество электронов, образуемое в результате этой окислительно-восстановительной реакции, пропорционально исходной концентрации этанола. Ацетон (наиболее избыточное эндогенное мешающее соединение, выделяемое с выдыхаемым воздухом) не окисляется на поверхности электрода, так что этот кетон не дает ложноположительной реакции. Однако, если присутствуют высокие концентрации метанола или изопропанола, они будут окислены в той же самой электрохимической реакции. Это особенно важно при интерпретации результатов, потому что изопропанол может быть образован эндогенно за счет восстановления ацетона, уровень которого в крови может возрасти у людей, долгое время лишенных пищи (голодание намеренное или вынужденное, диета), или диабетического кетоацидоза.

Другая группа устройств идентифицирует алкоголь и его концентрацию за счет поглощения в ИК-области. Селективность для идентификации этанола может быть повышена за счет комбинации ИК- и электрохимического детектирования.

Необходимо различать результаты, получаемые в начале и конце выдоха. Если первые значения превышают конечные, это означает присутствие «алкоголя рта» (прием алкоголя за 15-20 мин до анализа), недавний прием пищи или нарушение функции желудочно-кишечного тракта (отрыжка, «бурчание» и др.). Интерпретация количественных данных по выдыхаемому воздуху зависит от целей анализа. Если пациент находится под влиянием алкоголя в клинике на лечении, концентрацию алкоголя пересчитывают в предполагаемую концентрацию в венозной крови. Для этого используют фактор калибровки, который постоянен для всех индивидуумов. Считают, что концентрация 0,1 %о в крови приравнивается к 0,1 г/моль воздуха, т.е. 2100:1. Иногда используют фактор 2300:1 для улучшения аналитической точности.

Все приборы, используемые в анализе, калиброваны для оценки концентрации алкоголя в цельной крови, а не в ее плазме или сыворотке. При калибровке прибора на анализ в плазме фактор пересчета должен быть равен 2600:1, так как цельная кровь содержит примерно на 14% алкоголя меньше, чем такой же объем ее плазмы или сыворотки.

На практике, как правило, количественное содержание алкоголя оценивают по выдыхаемому воздуху. Определение алкоголя в выдыхаемом воздухе - простейшее исследование по исполнению — проводят при профилактических осмотрах и медицинском освидетельствовании на установление состояния опьянения. При выборе технических средств в этих случаях необходимо помнить, что применяемые технические средства должны быть зарегистрированы и разрешены для этой цели Министерством здравоохранения и социального развития РФ, а специалисты, их использующие, должны иметь соответствующие подготовку и специализацию, также определяемые МЗСР РФ.

В настоящее время приоритет обнаружения алкоголя в парах выдыхаемого воздуха принадлежит приборам, в основе которых — электрохимическая детекция (фиксация окислительно-восстановительного потенциала реакции окисления спирта) или измерение валентных колебаний ОН-группы, связанной водородной связью, или хемосорбции. Такие алкометры компактны, их можно использовать в передвижных лабораториях. Они обладают широким диапазоном измерения — от 0 до 4%о, с относительной погрешностью 3% по международным сертификатам и 10% — по российским, временем измерения до 60 с, временем установления рабочего режима — не более 30 с. Встроенные компьютеры позволяют удерживать в памяти до 100 исследований и более.

Оцените статью: (14 голосов)
4 5 14

Статьи из раздела Лабораторная диагностика на эту тему:
Алгоритм пренатального мониторинга беременности
Анализ наркотических средств
Механизм взаиморегуляции в системе «мать - плацента - плод»
Мониторинг беременности
Регуляции метаболизма организмов матери и плода


Новые статьи

» Стронгилоидоз
Стронгилоидоз
Стронгилоидоз - хронически протекающий геогельминтоз с преимущественным поражением ЖКТ и общими аллергическими проявлениями. Основной источник заражения стронгилоидозом - больной человек. Некоторые... перейти
» Трихинеллез
Трихинеллез
Трихинеллез у человека - это острый зооноз с природной очаговостью, протекающий с лихорадкой, мышечными болями, отеком лица, кожными высыпаниями, высокой эозинофилией, а при тяжелом т... перейти
» Энтеробиоз
Энтеробиоз
Энтеробиоз - кишечный гельминтоз, вызываемый мелкой нематодой Enterobius vermicularis, со стертым и невыраженным течением, наиболее распространенный признак которого - перианальный зуд, возникающий на... перейти
» Аскаридоз
Аскаридоз
Аскаридоз - кишечный гельминтоз, вызываемый нематодой Ascaris lumbricoides, протекающий с поражением ЖКТ, интоксикацией, аллергическими реакциями. Аскаридоз - один из самых распространенных гельмин... перейти
» Альвеококкоз
Альвеококкоз
Альвеококкоз (Alveococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепней Echinococcus multilocularis, с хроническим прогрессирующим течением, развитием в печени и других органах мн... перейти
» Эхинококкоз
Эхинококкоз
Эхинококкоз (Echinococcosis) - зоонозный биогельминтоз, вызываемый личиночной стадией цепня Echinococcus granulosus, характеризуемый хроническим течением и развитием преимущественно в печени, реже в л... перейти